孙 健 王 炎 王国娟 李 琦

上海中医药大学附属普陀医院 （上海中医药大学中西医结合肿瘤介入研究所），上海200062

中国是鼻咽癌（nasopharynegeal carcinoma，NPC）高发区，发病率占全世界80%以上[1]。目前，鼻咽癌的治疗以放射治疗为主，但5年生存率仅50%左右，因此，寻找有效的治疗手段和药物是鼻咽癌研究的热点[2]。去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）是由我国首先合成的一种抗肿瘤药物，是一种中药单体，目前已应用在多种肿瘤的实验和临床治疗研究[3]。目前，有关NCTD治疗鼻咽癌的研究尚未见报道。笔者研究了NCTD对鼻咽癌细胞CNE1增殖和凋亡的影响，为NCTD临床治疗鼻咽癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

去甲斑蝥素（山东平原制药厂，H37023401）。RPMI 1640培养液（GIBCO公司）；人鼻咽癌细胞株（CNE1）（中科院上海细胞库），37℃恒温，5% CO2密闭传代培养；PI染料（Sigma公司）；凋亡检测试剂盒（BD公司）。

1.2 方法

NCTD溶解于1640培养液，过滤后除菌，配制成100 mmol/L NCTD母液。用10%小牛血清的1640培养液将NCTD母液稀释成 10、20、40、60、80、100μmol/L 的工作液。

1.2.1 MTT比色法检测CNE1细胞的增殖 胰蛋白酶消化CNE1细胞并计数后，按每孔1×104个细胞接种于96孔细胞培养板内。24 h后，随机分为 7组，分别加入含0、10、20、40、60、80、100μmol/L的 NCTD 培养液，以 0μmol/L的 NCTD 为对照组。按NCTD的作用时间，24、48、72 h分别进行MTT检测。称取0.005 g MTT干粉，加入10 mL无抗生素的1640培养液中，过滤除菌，配成MTT工作液。96孔细胞培养板每孔加入100μL MTT工作液，培养4 h后，弃上清，每孔加入150μL DMSO，振荡器加速结晶紫溶解，570 nm酶标仪测定吸光度值，所有孔吸光度值都减去空白孔吸光度值处理。细胞增殖抑制率=（对照孔-实验孔）/对照孔×100%，根据抑制率作出NCTD作用曲线并计算半数抑制浓度IC50值。

1.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期 胰蛋白酶消化CNE1细胞并计数后，按每孔1×105个细胞接种于24孔细胞培养板内。实验分为4组，分别加入0、10、20、40μmol/L浓度的NCTD，每组设3个复孔。48 h后，消化并搜集细胞，PBS清洗2次。凋亡采用BD公司Annexin V ：FITC Apoptosis Detection Kit I试剂盒，处理方法参考相关说明书。采用FACScaliub流式细胞仪对样品进行检测， 每次计细胞数20 000个，分析软件Cell Quest计算凋亡率。检测细胞周期需在PBS液清洗两次后加入200μL固定液（2%小牛血清，70%乙醇，28%PBS）4℃固定1 h，PBS清洗2次，加入PI（终浓度50μg/mL）和无DNA酶污染的RNA酶（终浓度50μg/mL）500μL染色1 h，流式细胞仪检测DNA含量，ModFIT LT 2.0软件分析细胞周期。

1.3 统计学处理

所有实验数据采用SPSS11.0进行统计分析。计量数据均以（± s）表示。各组实验数据间进行方差分析，P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CNE1细胞的生长增殖情况

NCTD作用CNE1细胞48 h后，细胞生长受到抑制，这一抑制作用随NCTD浓度的升高而升高。图1为NCTD作用48 h后CNE细胞的生长情况。随着NCTD浓度升高，CNE1细胞数明显减少，并呈现皱缩、凋亡。

图1 NCTD作用48 h后CNE1细胞生长情况

2.2 MTT检测CNE1细胞增殖

不同浓度的NCTD作用细胞后，细胞生长受到不同程度的抑制，这一抑制作用随NCTD浓度的变化而变化，组间两两比较差异有统计学意义（P＜0.01），并且浓度和时间与抑制率间呈现明显的依赖效应（表1），NCTD对CNE细胞的IC50值24、48、72 h 分别为 86.5、40.8、28.2μmol/L。

表1 不同浓度NCTD作用于CNE细胞不同时间的抑制率（x ± s，%）

2.3 细胞凋亡的检测

不同浓度的NCTD作用细胞后，细胞生长受到不同程度的抑制并出现凋亡，凋亡率随着NCTD浓度的变化而变化，各加药组与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 48 h不同浓度NCTD作用组 CNE细胞的凋亡比例（x ± s，%）

2.4 细胞周期分析

不同浓度的NCTD作用细胞后，细胞生长周期发生改变，G2期细胞明显增多，G2期细胞比例随着NCTD浓度的变化而变化，各加药组与对照组比较差异均有统计学意义（P ＜0.01）。见表3。

表3 48 h不同浓度NCTD作用 CNE细胞后各期细胞比例变化（ ± s，%）

表3 48 h不同浓度NCTD作用 CNE细胞后各期细胞比例变化（ ± s，%）

NCTD浓度（μmol/L） G0/G1期 P S期 G2期 P 0 63.7±2.19 - 30.29±0.88 5.38±1.06 -10 68.55±1.26 ＜0.01 12.61±1.12 18.63±1.45 ＜0.01 20 66.15±1.43 ＜0.01 13.55±0.64 20.52±1.38 ＜0.01 40 56.56±2.22 ＜0.01 2.05±1.68 42.59±3.19 ＜0.01

3 讨论

细胞凋亡是细胞的一种主动、程序化生理过程，它的发生受到环境刺激、生理和病理等因素的调控。该过程的正常或紊乱与机体进行新陈代谢、保持自身相对稳定以及肿瘤发生等密切相关[4]。目前，很多药物和治疗手段都与诱导肿瘤细胞凋亡有关。NCTD是由我国上世纪80年代在研究斑蟊素的基础上首先合成的一种抗肿瘤药物，它可以抑制肿瘤细胞的DNA及蛋白质合成，诱导其凋亡。目前，NCTD主要用于消化系统肿瘤，尤其是肝癌的治疗。由于其副作用小，无肾毒性和骨髓毒性，是一种具有很大潜在应用价值的抗癌药物[5-8]。本研究结果显示，NCTD对体外培养的CNE1细胞的生长有明显的抑制作用，能够诱导CNE1细胞凋亡，阻滞细胞周期于G2期，抑制细胞分裂，且呈时间和剂量依赖性。

由于鼻咽癌恶性程度较高，早期即可出现颈部淋巴结转移，而且由于放化疗等治疗手段对患者身体有极大的损害，导致鼻咽癌患者的5年生存率较低[2]。近年来，中药复方和中药单体治疗鼻咽癌的优势逐渐显现出来[9-10]。中药在改善症状、提高生活质量、延长生存期等方面具有优势[11]。NCTD作为一种中药单体，对鼻咽癌细胞的生长有明显抑制作用和凋亡诱导作用，在其他肿瘤临床上的运用预示着NCTD作为抗肿瘤药物用于治疗鼻咽癌的潜在价值。

[1] 黄腾波.鼻咽癌高危人群，癌前病变与癌的早期检出[J].中国肿瘤，1996，5（5）：9.

[2] 谢冰芬，郝东磊，刘宗潮，等.茶多酚对鼻咽癌CNE2 细胞DNA损伤和细胞周期的影响[J].中国药理学通报，1999，14（15）：424-427.

[3] 李先茜，邵世和，傅桂莲，等.去甲斑蝥素诱导人肝癌细胞凋亡的研究[J].山东医药，2010，50（25）：9-11.

[4] Kerr JF,Wyllie AH,Currie AR. Apoptosis： a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics[J].Br J Cancer,1972,26:239-257.

[5] Sun ZX,Ma QW,Zhao TD,et al.Apoptosis induced by norcantharidin in human tumor cells[J].World J Gastroenterol,2000,6（2）:263-265.

[6] Liu XH,Blazsek I,Comisso M,et al. Effects of norcantharidin，a protein phosphatase type-2A inhibitor， on the growth of normal and malignant haemopoietic cells[J].EJC,1995,31A（6）:953-963.

[7] 周利红，李琦，范忠泽，等.去甲斑蝥素控释微球的肝动脉栓塞作用和急性毒性实验 [J].时珍国医国药，2009，20（5）：1045-1048.

[8] 黄雪强，凌昌全，宋田斌，等.去甲斑蝥素诱导人T淋巴细胞白血病细胞株凋亡的实验研究[J].浙江中医学院学报，2001，25（5）：49-52.

[9] 潘运宝，夏洪平，杨惠玲，等.复方小柴胡汤调控microRNA抑制鼻咽癌细胞增殖[J].分子诊断与治疗杂志，2010， 2（5）：323-327.

[10] 袁淑兰，王艳萍，陈晓禾，等.丹参酮IIA诱导人鼻咽癌细胞凋亡及其作用机制的体外实验研究[J].华西医大学报，2002，33（1）：84-86.

[11] 肖颖，李覃.中医药抗肿瘤作用机制的研究进展[J].中国医学杂志，2008，6（3）：38-40.