江 红 匡洪宇 马丽丽 朱雪磊 段 鹏 康英英

哈尔滨医科大学附属第一医院（黑龙江哈尔滨150001）

糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病最常见的严重微血管并发症，可导致失明。其发病机制尚不明确，研究认为在DR中早期周细胞丢失是周细胞发生了凋亡，氧化应激可能诱导周细胞的凋亡。目前研究认为氧化应激是高糖诱导周细胞胞凋亡的中心环节[1]。本实验通过研究高浓度葡萄糖下培养的牛视网膜微血管周细胞凋亡情况，探讨黄芪有效部位的提取物——黄芪总黄酮对牛视网膜微血管周细胞凋亡及凋亡基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 药物 取黄芪10kg，以95%乙醇减压回流提取3次，合并，浓缩至浸膏，取浸膏加蒸馏水溶解，用醋酸乙酯萃取数次，合并萃取液，浓缩，过柱，得总黄酮，提取物由黑龙江中医药大学药理学实验室鉴定。临用前以磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至所需浓度。

1.2 试剂与仪器 DMEM培养基（低糖，美国Hyclone公司），优级胎牛血清（天津灏洋生物公司），胶原酶Ⅱ型（美国Invitrogen公司），双抗（大连美罗大药厂），胰酶、多聚赖氨酸、单克隆抗体及免疫组化试剂盒（武汉博士德生物公司），超氧化物歧化酶测试盒（南京建成生物工程研究所）、丙二醛测试盒（南京建成生物工程研究所）、正常熔点琼脂糖（西班牙Biowest公司）、低熔点琼脂糖（德国Merck-Darmstadt公司）。荧光显微镜，DYY-32型电泳仪以及细胞培养相关材料。

1.3 视网膜毛细血管周细胞的原代培养 培养方法参照文献[3]。分离胎牛眼视网膜，匀浆，0.2%胶原酶37℃消化40min，200目筛网过滤，离心，加入含20%胎牛血清DMEM培养液，接种入50cm培养瓶中，在37℃含5%CO2及90%湿度培养箱中培养。倒置相差显微镜观察细胞生长形态，再去除培养液，烤干后采用鼠抗α平滑肌肌动蛋白抗体及兔抗神经胶质纤维酸性蛋白抗体，进行视网膜血管周细胞免疫组化鉴定。

1.4 分组培养 取体外培养3代融合的周细胞，用培养液配成单个细胞悬液，调整细胞密度为1×107/L，接种于96孔培养板内。细胞贴壁后更换不同浓度的葡萄糖培养液。对照组加入含20%胎牛血清的DMEM（5.5mmol/L）；模型组加入葡萄糖培养液（25mmol/L）；黄芪总黄酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组先加入葡萄糖培养液（25mmol/L），再分别加入 0.25、0.5、1.0、2.0mg/mL 的黄芪总黄酮孵育6d。

1.5 超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量检测SOD活力测定采用黄嘌呤氧化酶法；MDA测定采用硫代巴比妥酸比色法。取周细胞培养上清50μL，按照试剂盒说明进行，使用722可见分光光度计测定吸光度，SOD活力及MDA含量。

1.6 统计学处理 应用SPSS 10.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析及直线相关回归分析方法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞鉴定 倒置相差显微镜下观察，原代培养的BRPs 1～2d后贴壁，贴壁后逐渐伸展，呈不规则多角形，胞体不大，可见突起，生长较快，1～2周BRPs可达到融合，细胞密集，无接触性抑制。α平滑肌肌动蛋白抗体染色显示BRPs胞浆内呈特异性棕黄色着色，阳性率达99%以上，兔抗神经胶质纤维酸性蛋白抗体免疫组织化学染色BRPs胞浆不着色。

2.2 黄芪总黄酮对周细胞MDA及SOD的影响 与模型组相比，黄芪总黄酮各组周细胞MDA含量降低、SOD活力减弱（P＜0.01）；并随着黄芪总黄酮质量浓度的增加，MDA含量降低呈现一定的剂量-效应关系，差异具有统计学意义（P＜0.01）。而SOD活力并无明显的剂量依赖性。黄芪总黄酮各组MDA/SOD减小，与模型组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）；并随着黄芪总黄酮浓度的增加，呈现一定的剂量-效应关系，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

视网膜组织是眼睛的多层感觉组织，富含多不饱和脂肪酸，它对ROS和脂质过氧化物特别敏感.自由基活性增强和抗氧化能力降低是DR发生的重要机制。研究证实抗氧化剂的应用不仅能抑制氧自由基诱导的细胞凋亡，而且能防止糖尿病微血管并发症的发生[3]。

表1 各组MDA含量及SOD活性比较 （±s）

表1 各组MDA含量及SOD活性比较 （±s）

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与黄芪总黄酮Ⅰ组比较，▲P＜0.01；与黄芪总黄酮Ⅱ组比较，#P＜0.01；与黄芪总黄酮Ⅲ组比较，○P＜0.01。

SOD（U/mL） MDA/SOD组 别对照组模型组MDA（nmol/L）2.17±0.27 7.42±1.11**10.43±1.01 0.21±0.02 21.92±1.06** 0.34±0.04*黄芪总黄酮Ⅰ组 7 7.11±0.71** 20.62±0.63** 0.33±0.44*黄芪总黄酮Ⅱ组 7 5.74±0.46**△△▲ 18.46±0.59**△△▲ 0.31±0.03*△黄芪总黄酮Ⅲ组 7 4.77±0.28**△△▲# 16.04±0.48**△△▲# 0.29±0.02*△黄芪总黄酮Ⅳ组n 7 7 7 3.01±0.16**△△▲#○13.36±0.26**△△▲#○ 0.22±0.01△▲

黄芪具有改善循环、降糖、抗氧化、抗衰老、调节免疫等多种功效，已有临床研究证实以黄芪为主要成分的中药颗粒对保护周细胞、防止周细胞消失及基底膜增厚有较好疗效。黄芪总黄酮是黄芪有效部分提取物，实验表明其可降低细胞脂质过氧化物的生成，直接清除羟自由基和超氧阴离子自由基，提高SOD细胞活性，对自由基所致细胞膜、蛋白质以及DNA损伤有明显的保护作用。而最近研究发现黄芪总黄酮具有抗突变、抗肿瘤和抑制动脉粥样硬化等多种生物学效应[4]。

本研究用其进行体外细胞试验，观察了黄芪总黄酮对体外培养牛视网膜微血管周细胞氧化应激的影响。结果显示一定质量浓度的黄芪总黄酮对高糖培养下的牛视网膜微血管周细胞氧化应激有明显的抑制作用，且随着黄芪总黄酮质量浓度的增加，周细胞的氧化损伤降低。结果提示黄芪总黄酮对视网膜血管周细胞有一定保护作用，是一种很有前途的临床抗氧化剂。（第一作者现在黑龙江省医院工作）

[1]Rolo A P，Palmeira CM.Diabetes andmitochondrial function：role of hyperglycemiaand oxidativestress[J].ToxicolApplPharmacol，2006，212（12）：167-178.

[2]Li AF，Sato T，HaimoviciR，etal.High glucose alters connexin 43 expression and gap unction intercellular communication activity in retinalpericytes[J].InvestOphthalmol Vis Sci，2003， 44（12）： 5376-5382.

[3]Mohr S，Xi X，Tang J，etal.Caspase activation in retinasof diabetic andgalactosemicmice and diabetic patients[J].Diabetes，2002，51（6）：1172-1179.

[4]汪德清，田亚平，向兰.黄芪总黄酮生物学活性作用的化学成分基础研究[J].军医进修学院学报，2006，27（1）：13-15.