朱 浩 范晓波 贺 劲 廖艳林 杨祥坤湖北省武汉市中医院（湖北武汉430014）

心律失常是心血管病常见的致死因素，目前缺乏十分有效的减少心律失常发生的药物。本研究采用全细胞膜片钳记录技术来观察宣导泻肺饮含药血清对大鼠心室肌细胞L-型Ca2+通道的影响，以探讨宣导泻肺饮含药血清药理作用相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料 成年SD大鼠 30只，清洁级，体质量200～250g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。宣导泻肺饮浓缩液由武汉中医院制剂室提供；小牛血清蛋白（BSA）、胶原酶Ⅱ型、牛磺酸和氯化铯（CsCl）购自美国Sigma公司；天门冬氨酸合L-谷氨酸由中国科学院上海生物化学研所提供；其他试剂均为国产分析纯或化学纯试剂。

1.2 宣导泻肺饮含药血清的制备 SD大鼠随机分为空白血清组和宣导泻肺饮含药血清组，各15只。含药血清组按0.55g/kg加蒸馏水3mL，配制成宣导泻肺饮流浸膏药液灌服，每日1次，连续8d。空白血清组给等体积生理盐水灌胃，方法同含药血清组。在末次灌胃2h后固定大鼠，眼眶采血。室温下静置30min后取上清液，2500r/min离心25min，分离血清，置于56℃水浴30min灭活，过0.22μm孔滤膜滤过除菌，分装，-20℃条件下保存备用。

1.3 心肌单细胞的分离 大鼠经苯巴比妥钠麻醉后迅速取出心脏，立即置冰冷饱和氧的无钙台氏液中进行修剪，然后经主动脉将心脏悬挂于Langedorff灌流器上，以正常台氏液约8mL连续灌流5min，然后用无钙台氏液灌流约10min至心脏停搏，换胶原酶液灌流分离心脏单细胞，待心脏变软和膨松变大，心肌呈粉红色半透明时，可以开始取心脏组织。然后用KB液冲洗残酶约3～5min，最后将心脏从Langendorff装置上取下，剪下心室置于37℃冰箱KB液中剪碎，将取下的心室肌组织放于装有KB液的试管中，在温育下用粗头吸管轻轻吹打3～5min，使之分散成单个细胞，经过150～200μm的微孔尼龙膜滤过后于KB液中室温下（15～25℃）静置0.5～1h后复钙，然后进行实验。

1.4 玻璃微电极的制备 1.20mm玻璃微电极，内径0.9～1.1mm，壁厚 0.10～0.15mm，管长100mm，应用P-97程控水平微电极拉制器（USA）经两步拉制，调节两步的时间和速度设置，拉制出左右两根电极，充灌电极液后，排除尖端气泡备用。一般尖端电阻为2～4MΩ。

1.5 全细胞膜片钳记录 将复钙的细胞悬液加入细胞池中，并置于倒置显微镜工作台上，待细胞沉底贴壁（5～10min）后，室温下用台氏液或L型钙通道的细胞外液灌流，流速2～4mL/min。将充灌电极内液（L型钙通道的电极内液）的玻璃微电极安装在探头的电极夹持器上。EPC-10double膜片钳放大器系统通过D/A和A/D转换卡由计算机控制刺激发放和信号的采集。移动Sutter三维电动显微操作器将略带正压的电极尖端轻压在横纹清晰的杆状细胞上，轻施负压待吉欧姆封接形成后，正确补偿快电容的前提条件下，用骤发较大负压吸破细胞膜，小心补偿慢电容，打开串联电阻补偿，将补偿率调至50%～80%左右。全细胞膜片记录即告形成。

1.6 观察宣导泻肺饮含药血清对大鼠心室肌细胞ICa-L的影响 心肌细胞完成封接破膜补偿快慢电容及串联电阻后，MODE置向VC后进行ICa-L记录：钳位电位-40mV，以除极化至0mV，持续200ms的阶跃脉冲激活L-型钙通道 （ICa-L）：以从-30mV至+60mV，阶跃 +10mV，脉宽为200ms的命令电压钳制记录峰值工ICa-L的电流-电压曲线；电流峰值以内向峰电流值与100ms后电流值之差计算。观察电极外液灌流（对照组）和宣导泻肺饮含药血清10%，30%的稀释血清后电流幅值和门控动力学的影响。用异搏定（维拉帕米）可阻断此电流，从而证明此电流为ICa-L（Cs+已将K通道阻断，钳位于-40mV Na+通道已失活）。

2 结 果

2.1 分离细胞的形态学 ZEISS倒置显微镜（Germany）下可见单个心室肌细胞星棒状或杆状，细胞膜表面光滑，横纹清楚且排列整齐。复钙后部分心肌细胞有自发性收缩，短时间内挛缩，变圆成死亡细胞，而大部分呈静止状态可供做实验使用。获得60%以上横纹清晰的杆状耐钙活细胞，且可以成活8h以上。

2.2 分离细胞的钙电流 压钳模式下以10mV的步长使心室肌细胞由-40mV的钳位电位逐步去极化至+50mV，刺激持续250ms，记录到一个缓慢失活的内向电流，在此条件下，钠通道和T-型钙通道几乎被完全抑制，电极内液中又加入了Cs+，可以消除钾通道电流的影响。在灌流的外液中加入10mmo1/L的维拉帕米可以几乎完全阻断上述的电流，实为慢钙电流。

2.3 不同浓度宣导泻肺饮含药血清对大鼠心室肌细胞钙通道电流的影响 见表1、图1。不同浓度的宣导泻肺饮含药血清灌流心室肌细胞5min明显抑制ICa-L。冲洗后可见ICa-L有所恢复，其降低无显著差异。不同浓度的宣导泻肺饮含药血清对心室肌细胞的Ica-L呈浓度依赖性抑制。图1示不同深度的宣导泻肺饮含药血清作用下的ICa-L电流-电压曲线，可见其形状未发生明显改变。

3 讨 论

心律失常的发生与心肌电生理特性异常有关，而心肌电生理特性又与心肌细胞上的Ca2+离子通道密切相关[1-3]。目前临床上使用的抗快速性心律失常西药有4类，除Ⅱ类属于β受体阻断剂以外，其余均作用于不同的离子通道，而产生抗心律失常的作用。目前心血管人工合成药的研究较多，因此人们已将其注意力转移到天然药物和中药的研究上，且随着分离技术的发展和提高，抗心律失常中药的研究已经从复方、单味药深入到有效的单体成分上[4]，现己发现抗心律失常的中药单体有十几种，如：黄连素，钩藤碱，红花黄素，关附甲素，人参三醇等[5-8]，从目前对它们抗心律失常的电生理的研究来看，大多数是属于Ⅲ类抗心律失常药。

表1 不同浓度宣导泻肺饮含药血清对不同电压下大鼠心室肌细胞 ICa-L（pA）的影响 (n=6，±s）

表1 不同浓度宣导泻肺饮含药血清对不同电压下大鼠心室肌细胞 ICa-L（pA）的影响 (n=6，±s）

与对照组、冲洗后比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

电压（mV）-30-20对照组21.50±9.40 127.10±36.50 10%含药血清组13.30±4.30**101.90±44.50 30%含药血清组10.10±2.90**89.60±27.20**冲洗后19.20±3.90 123.30±46.70-10 299.70±89.90 227.10±87.10 182.10±45.70** 270.00±84.80 0 586.50±111.30 449.40±107.70 311.10±99.70** 544.00±136.90 10 631.30±156.50 537.70±135.10* 36.00±123.70** 610.20±135.80 20 580.90±121.30 481.60±97.70* 317.10±117.10** 551.40±136.50 30 475.30±139.30 390.30±95.10* 226.10±67.30** 446.00±95.80 40 276.70±36.50 201.10±44.50** 140.10±37.10** 223.10±46.70 50 127.10±36.50 101.90±44.50 63.70±5.50** 117.30±46.70 6016.70±7.1012.70±6.209.20±2.80**14.50±5.70

图1 不同浓度宣导泻肺饮含药血清作用下Ica-L的电流-电压曲线

众所周知，动作电位的去极化（0期）是与Na+离子通道开放，Na+内流有关；而复极化均与 K+，Ca2+通道有关，现在发现与心肌复极化有关的K+电流有多种，主要有一过性外向钾电流、内向整流钾电流和延迟整流钾电流。有报道认为，内向整流钾电流主要作用维持心肌细胞的静息电位和动作电位3期快速复极过程，延迟整流钾电流则参与整个复极过程并与ICa一起共同维持动作电位复极化2期，而细胞内钙超载是心肌缺血/再灌注损伤的中心环节，对细胞的损伤起关键作用。

宣导泻肺饮是笔者课题组在叶天士经验基础上，加以化裁用以治疗心悸的经验方，方中主要药物组成为：葶苈子、桑白皮、杏仁、厚朴、陈皮、莱菔子、猪苓、泽泻、川木通、当归。本方用药，三焦兼顾，而以葶苈子、桑白皮开宣上焦为君，莱菔子、猪苓分入中下二焦为臣，余药助君臣之力为佐。诸药合用，宣上和中渗下，使上宣中和下达，三焦气机通畅，共奏宣导三焦，泻肺豁痰，活血利水之功。药理研究发现宣导泻肺饮组方中主药葶苈子有强心作用，使家兔心电图见有P波变低和洋地黄型的双向T波等[9]。

本实验利用细胞膜钳技术，进一步在分子水平研究宣导泻肺饮对Ca2+通道的影响，结果表明，宣导泻肺饮对Ca2+通道有抑制作用。在分离的单个心室肌细胞上所记录到的Ca2+电流其特性，具有电压依赖性，在去极化时被激活。因此推测宣导泻肺饮可能是通过抑制慢钙通道来缩短APD，APD50，从而缩短有效不应期，发挥其抗心律失常的作用。

本研究证明宣导泻肺饮可抑制电压门控性钙通道的外钙内流和减少肌浆网的内钙释放，从而减少大鼠心室肌细胞[Ca2+]i，对心室肌细胞产生保护作用。

[1]赵兰平，李建东，商爱民，等.腺苷对豚鼠左心室流出道自律细胞的电生理效应[J].基础医学与临床，2011，31（2）：174-178.

[2]戴德哉.严重心律失常的相关离子通道病及分子机制探讨 [J].生命科学，2008，20 （1）：69-75.

[3]马丽娟，张雨薇，张文杰.大豆异黄酮对过氧化氢诱导大鼠心肌细胞内钙超载的影响[J].中国老年学杂志，2010，30（16）：2313-2315.

[4]郭继鸿.抗心律失常中药的应用优势 [J].中国循证心血管医学杂志，2010，2（4）：198-201.

[5]王春艳，王桂茹，李晶.盐酸小檗碱抗实验性心律失常的研究[J].中国老年学杂志，2009，29（6）： 651-653.

[6]王盟，刘卫.钩藤总生物碱的研究进展[J].实用医药杂志，2008，25（3）： 360-362.

[7]杨红，魏宗德.红花黄色素与心血管疾病的研究进展 [J].西南军医，2009，11（1）：83-85.

[8]蒋晓林，孙晓晖，顾宇重.参松养心胶囊治疗老年糖尿病心律失常的临床观察[J].河北中医，2010，32（7）：1046-1048.

[9]林启寿.中草药成分化学[M].北京：科学出版社，1977：138.