吴川 王秀丽 王倩 刘彦涛 董蕊 刘朋

糖尿病神经病理性痛(diabetic neuropathic pain，DNP)发病机制尚不完全清楚，可能与高血糖引起的神经营养与代谢障碍有关［1］，而细胞凋亡参与了糖尿病神经痛的发生发展［2］，但DNP大鼠脊髓背角神经元凋亡机制目前仍不十分清楚。本试验利用DNP大鼠模型，对脊髓背角的凋亡细胞及与之相联系的凋亡蛋白酶caspase-3进行了观察，以探讨在DNP的发展过程中，脊髓背角凋亡细胞及凋亡蛋白caspase-3的变化。

1 材料与方法

1.1 动物选择及分组 清洁级雄性SD大鼠60只，由河北医科大学动物试验中心提供，4周龄，体重150～170 g，室温20～25℃，昼夜交替，自由进食水，适应环境5 d进行试验。随机分为正常对照组(C组)和DNP组(D组)，每组30只。

1.2 DNP模型的制备 参考文献［3］介绍的方法，禁食12 h后腹腔注射链脲霉素(STZ，批号:S0130，Sigma公司，美国)50 mg/kg，C组给予等容量0.9%氯化钠溶液。分别给予注射STZ 或0.9%氯化钠溶液后1、2、3 周采集尾静脉血样0.5 ml，采用酶学方法测定空腹血糖浓度，ACCU-CHEK血糖分析仪由德国Roche公司提供，D组空腹血糖浓度＞16.7 mol/L为糖尿病模型制备成功，否则剔除，予以补充。采集血样后待大鼠安静后用Von Frey针测定机械缩足阈值;当缩足阈值低于4 g时为糖尿病神经痛模型成立;在腹腔注射后3、5、7周取L1～5节段脊髓组织，采用TUNNEL法和免疫组织化学法染色分别测定凋亡细胞与凋亡蛋白酶Caspase-3的表达。

1.2.1 机械缩足阈值的测定:参照文献［3］介绍的方法，采用“up-and-down”方式，将大鼠置于金属网上，盖以透明的有机玻璃罩。使大鼠适应环境15 min，用一系列标准化的Von Frey针(Stoelting Wood公司，美国)垂直刺激大鼠后足底，使其弯曲成S形，持续8 s，在刺激时间内或在移开Von Frey丝时发生缩足反应，记为阳性反应，直至出现第1次阳性阴性(或阴性阳性)反应的骑跨，连续测4次。采用Dixon［4］介绍的方法计算50%缩足反应阈值。

1.2.2 取材:分别于注射前、注射后3、5、7周每组各取10只大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉下，迅速开胸，经左心室至升主动脉插管，先以100 ml 0.9%氯化钠溶液洗去血液，随后用含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH值7.4)灌注1 h，取L1～5节段脊髓组织。常规固定、脱水、石蜡包埋，切片(片厚5 μm)。分别行原位末端标记法(TUNEL)和caspase-3免疫组化染色。

1.2.3 TUNEL法染色:TUNEL法检测步骤按试剂盒(购自德国Roche公司)说明书进行。过氧化物酶二氨基联苯胺(DAB)显色，阳性细胞为细胞核中有棕黄色颗粒。阴性对照:未端脱氧核苷酸转移酶(TDT酶)用含有核苷酸混合液的反应液替代，其余步骤均相同。Olympus光学显微镜×400倍下观察并计数大鼠脊髓背角TUNEL标记的阳性细胞数。根据细胞的形态、大小、分布区域等，确认脊髓背角TUNEL标记的阳性细胞数。

1.2.4 caspase-3免疫组织化学法染色:采用免疫组织化学染色法进行抗caspase-3染色，操作步骤按试剂说明书进行。兔抗大鼠caspase-3多克隆抗体(美国Santa Cruz公司，1∶200)，生物素标记的羊抗兔IgG(1∶200)和辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素(1∶100)均购自美国 Zymed公司。阴性对照用0.01 mol/L PBS代替caspase-3抗血清，其余步骤均相同。在Olympus光学显微镜×400倍下观察并计数整个脊髓背角内caspase-3免疫反应阳性细胞数。采用Motic Digital Image病理图像采集软件(Olympus公司，日本)与 Quantity One软件(Bid-Rad公司，美国)进行分析，每个标本取4张切片，每张切片在脊髓背角选取大致相同部位的视野，光镜(200倍)计数阳性细胞数，取4张切片的平均值反映TUNEL染色和caspase-3阳性细胞的表达水平。

1.3 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用成组设计t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组空腹血糖和机械缩足阈值比较 给予STZ后不同时点机械缩足阈值＜4 g;与C组比较，D组空腹血糖升高，机械缩足阈值降低 (P＜0.05)。见表1。

2.2 2组脊髓脊角凋亡细胞及Caspace-3表达比较 注射3周后与C组比较，D组各时点凋亡细胞及caspase-3表达均显著增加(P＜0.05)，D组各时间点之间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表1 2组大鼠给予STZ后不同时点空腹血糖及机械缩足阈值的比较n=10，

表1 2组大鼠给予STZ后不同时点空腹血糖及机械缩足阈值的比较n=10，

注:与C组比较，*P＜0.05

组别 血糖(mmol/L)机械缩足阈值(g)3周 5周 7周3周 5周 7周.2±2.8 D 组 24.4±3.6* 27.3±3.1* 26.7±3.4* 2.9±0.4* 3.1±0.4* 3.2±0.5 C 组 5.4±0.6 5.0±0.8 4.9±0.8 12.9±2.1 13.8±2.8 11*

表2 2组大鼠给予STZ后不同时点脊髓背角凋亡细胞及Caspase-3表达的比较n=5，

表2 2组大鼠给予STZ后不同时点脊髓背角凋亡细胞及Caspase-3表达的比较n=5，

注:与 C 组比较，*P＜0.05;与3周比较，#P＜0.05;与5周比较，△P＜0.05

方法C组D 组3周 5周 7周3周 5周 7周TUNEL法 77±11 81±11 80±14 138±15* 217±14*# 322±13＊△Caspase-3染色 99±20 95±21 99±20 168±16* 230±20*# 336±20＊△

2.3 染色观察 于脊髓背角可以观察到TUNEL染色阳性的细胞核，呈棕黄色或黄色，对照组偶可见TUNEL阳性细胞的表达。表达caspase-3阳性的细胞呈棕黄色，免疫阳性反应物多定位于神经元胞浆与突起的根部，胞核有时也有表达，在对照组可见少量表达。见图1、2。

3 讨论

糖尿病神经病变是糖尿病最常见的并发症之一，其发病机制复杂，与代谢、血管病变等因素有关［5］，糖尿病所致高血糖、脂质代谢紊乱、神经内膜缺血可导致机体过度氧化应激。而氧化应激是糖尿病周围神经病变的基础［6］。高血糖可引起内皮细胞中核转录因子(NF-κB)的激活，导致活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)生成增多，从而诱导神经元发生退行形变［7］，导致神经元的凋亡坏死、结构与功能发生改变。而随着糖尿病周围神经病变病程的进展，脊髓背角神经细胞凋亡变化的规律，未见明确报道。我们通过腹腔注射STZ，并于注射后1周开始抽取大鼠尾静脉血检测血糖，确保制造成功的糖尿病大鼠模型，应用up-and-down法确保DNP大鼠造模成功。通过对糖尿病周围神经病变进程不同时点大鼠模型脊髓背角凋亡细胞及与之相关联的凋亡蛋白caspase-3进行研究，以探讨随着糖尿病周围神经病变的进展，脊髓背角神经元凋亡细胞与凋亡蛋白caspase-3的表达变化。

图1 2组大鼠脊髓背角凋亡细胞(TUNNEL×400)

图2 2组大鼠脊髓背角凋亡蛋白Caspase-3(免疫组化×400)

研究认为:神经元暴露在高糖状态下2 h即可产生明显的氧化应激反应，并启动细胞的程序化死亡即细胞凋亡［8］。在糖尿病的动物中，过氧化应激对神经胶质细胞的损伤造成DPN中的脱髓鞘病变，导致神经传导速度减慢及痛觉的出现。氧化应激反应还可通过细胞内的各种调节通路激活细胞信号转导分子，如NF-κB、MAPKs等，最终改变细胞内的基因表达、蛋白功能，使内皮细胞和神经元功能失调、细胞凋亡［9，10］。另外，高血糖本身还可通过产生advanced glycation end products(AGE)而破坏血管内皮功能，AGE与其受体结合，激活NF-κB，引起血管炎症，形成糖尿病神经血管病变，最终导致血管神经细胞生成减少，凋亡增加［11］，这是目前认为引起DNP的病理学基础。

神经元氧化应激发生后，神经元异常放电频率增加，表现为神经元兴奋性增高［12，13］，在这一系列的反应中，ATP信号的级联反应、胶质细胞的活化、电压门控的离子通道(K+、Ca2+)、PKC/PLC活性均发挥重要作用，同时也与P38和JNK信号通路的活化状态密切相关［6］。而糖尿病的糖代谢异常，直接影响了细胞外的三磷酸腺苷(extracellular adenosine triphosphate，excATP)的生理作用，使excATP生成发生变化［14］。excATP是各种病理生理条件下释放到细胞外并进入细胞间质的ATP，它并不能直接向细胞提供能量，但可以在细胞间充当信使，传递神经递质和炎性介质，是神经病理性疼痛进程中一种重要的胶质细胞活化始动因子。研究证实:在高血糖状态下，细胞内第二信使二酰甘油合成增加，并与PKC亚型调节区结合，从而激活PKC，PKC通路的激活导致下游基因表达变化，如激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，使转录因子氧化磷酸化，改变基因表达，进而提高细胞内氧化应激水平［15，16］。在上述一系列变化中，Ca2+的参与必不可少［16］，该通路也是目前治疗DNP的一个新靶点。

Caspases即半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，Caspases的超表达和激活可导致细胞凋亡的发生，因此Caspases又被称为死亡蛋白酶，其中Caspases-3是介导细胞凋亡的核心蛋白［17］。本实验发现:注射STZ 3周后，脊髓背角凋亡细胞及其与之相联系的Caspases-3蛋白表达均明显增强，表明糖尿病大鼠氧化应激反应启动 MAPK通路和Caspase通路，Caspase可激活MAPKs通路中的上游蛋白激酶，诱导JNK和(或)p38磷酸化，表达P53和fas配体，及核转录因子(NF-κB)，从而诱导细胞凋亡。

本实验证实了随着糖尿病周围神经病变的发展，脊髓背角神经元的凋亡表达呈递增趋势。明确了糖尿病周围神经病变与脊髓背角神经元凋亡的关系，将为理解及治疗糖尿病周围神经病变提供新的思路与方法。

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