刘 洋 张丽华 薄 艳

1.吉林省吉林市中心医院药学部，吉林吉林132002；2.北华大学药学院，吉林吉林132013

中药材的真伪优劣直接影响着中药的质量和疗效。许多研究建立了一系列有效评价药材质量的方法，其鉴定标准也从最初仅有性状，逐渐增加了显微、理化、色谱、光谱等方法[1]。但是，对一部分药材，例如鹿鞭，仅以上述方法难以达到鉴定目的。因此人们不断研究更完善、更准确、更具科学性的方法来解决药材鉴定问题。随着分子生物学技术的飞速发展，特别是微量DNA提取技术和PCR技术的发展，从药材中提取微量DNA进行分析，为用DNA分析技术鉴定药材提供了可能。鹿鞭（Testis et penis cervi）乃名贵药材，系鹿科动物梅花鹿（Cnippon temminck）、马鹿（CelaphusL.）的雄性外生殖器。功效是补肾、壮阳、益精。常见伪品牛鞭，两者性状相似。市场上经常以牛鞭充当鹿鞭，较难区分。本实验采用分子生物学方法，进行鹿鞭的DNA鉴定。

1 样本

新鲜梅花鹿鞭1个，500 g。新鲜马鹿鞭1个，1000 g。由长白山野生生物资源重点野外观测实验站提供。新鲜部分牛鞭1个，600 g，由吉林市牛马行农贸大厅购买。

2 方法

2.1 新鲜品鹿鞭及牛鞭mtDNA的PCR鉴定

采用碱变性法提取并纯化新鲜品和中药材鹿鞭与牛鞭的mtDNA[2]。采用软件Primer Premier5.0进行引物设计，Oligo 6.0进行验证。由上海生工技术服务有限公司合成。上游引物 5’-CCCTCAGAATGATTGTCCTCA-3’，下游引物 5’-ATCCAACATCACAGCATGATG-3’。以提取的新鲜品鹿鞭及牛鞭mtDNA为模板，PCR扩增反应程序如下：94℃5 min，94℃30 sec，58℃ 30 sec，72℃ 30 sec，72℃ 10 min。新鲜品梅花鹿鞭、马鹿鞭、牛鞭的扩增产物各取6 μL，加2μL 6×loading Buffer，点样于2%琼脂糖凝胶中，以1×TBE为缓冲液，DNA MarkerⅠ为DNA Mark，70 v电压，进行电泳。30 min后，EB染色，凝胶成像分析系统观察和分析结果。

2.2 序列分析

2%琼脂糖凝胶电泳分离新鲜品鹿鞭的目的片段，片段回收，上海生工技术服务有限公司进行纯化和测序。测序结果按照参考文献进行比对[2]。

3 结果

3.1 新鲜品鹿鞭的PCR鉴定

以新鲜品梅花鹿鞭、马鹿鞭及牛鞭线粒体DNA为模板，加入鹿鞭特异性引物后，梅花鹿鞭、马鹿鞭可扩增出306bp大小的目的基因片段，牛鞭未能扩增出相应的基因片段。结果见图1。

图1 新鲜品鹿鞭的PCR鉴定结果图

3.2 鹿鞭Cytb基因片段的序列分析

本研究中所测鹿鞭的线粒体Cytb序列与GenBank中梅花鹿鞭的序列同源性为99%，与牛鞭线粒体Cytb无同源性。

4 讨论

鹿鞭为名贵中药材，价格高，市场上屡见伪品，其鉴定研究主要集中在药材的性状鉴别和化学分析两方面。本实验采用碱变性改良法，可提取出1 5800 bp完整的鹿鞭mtDNA。同时，以提取的鹿鞭mtDNA 作模板，设计线粒体Cyt b基因特异引物可扩增306 bp片段，而以牛鞭为模板未扩增出相应的片段，测序结果显示，Cyt b基因的306 bp片段序列与GenBank中梅花鹿及马鹿鞭的序列同源性为99%。说明这对Cytb基因特异性引物可作为鹿鞭鉴定指标之一[3-7]。

从本研究结果来看，将分子遗传学技术引入到组织、器官类的动物药材的检验中是可行的，显示用以上技术鉴定动物药材的有效性和可靠性。

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