冯秀梅 王 艳

吉林省吉林市红十字中心血站，吉林吉林 132001

近年来，国内已有部分血站使用NAT筛查献血者。根据我国现行的法定要求，采供血机构对献血者病毒血清学检测项目主要为HBsAg、抗-HCV、抗-HIV和抗-TP，ELISA方法检测[1]的筛查模式已极大地降低了输血传播疾病的风险，但因输血而患传染病的情况仍然时有发生[2]，主要因为我国属于肝炎的高发区，人群中HBsAg携带率为9.09%，HBV流行率＞60%[3]， 抗-HCV阳性率也达到了3.2%[4]，艾滋病也有快速发展的趋势。现有的血清学方法避免不了对病毒感染“窗口期”的漏检，而近年来发展的高度敏感、特异的核酸扩增技术（NAT）可使HBV、 HCV和 HIV病毒的“窗口期”明显缩短[5]，大大提高了输血和血液制品的安全。现将笔者所在血站2010年12月～2011年7月ELISA检测阴性献血者的标本进行NAT检测的情况报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源

2010年12 月～2011年7月采集的无偿献血者全血标本中，经ELISA方法检测阴性的标本共18 751份，其中男10 230人，女8 521人。采血后用3支5 mL EDTA抗凝真空试管（其中两支带分离胶，1管不带分离胶），保存于2～8℃冰箱，24 h内分离血浆，1管不带分离胶的用于免疫4项、ALT、血型等检测，1管带分离胶的用于NAT检测，另外1管用于标本保存备用。

1.2 仪器

Roche Cobas S201全自动核酸提取、扩增检测系统，Hamilton star全自动混样仪，Cobas Ampilprep核酸提取仪，Cobas Taqmen Analyzer核酸扩增检测仪，Fame24/20酶免分析仪，Freedom evo clinical全自动加样仪，elecsys 2010电化学发光分析仪，KUBOTA 8420低速离心机，MPR-141OR冰箱。

1.3 试剂

ELISA 筛查试剂：HBsAg（上海科华、厦门新创），HCV（上海科华、厦门新创），HIV（珠海丽珠、北京万泰）。NAT试剂：核酸定性筛查试剂盒（Cobas TaqScreen MPX test）。确证试剂：HIV、HCV、HBV（COBAS Ampliprep/ COBAS TaqMan），elecsys 2010电化学发光分析仪配套试剂。以上所使用的试剂均为国家生物检定所批批检定合格，且在有效期内使用。

1.4 方法

将用ELISA方法检测阴性的标本，再用全自动加样仪和全自动核酸提取、扩增系统进行混样检测，每一级混样池包含6个献血者标本，每个标本取167 mL血浆至一级混样池，用全自动混样议加样，一级混样池标本采用Cobas TaqScreen MPX test试剂，在全自动核酸提取仪中应用MGP磁珠分离技术原理提取核酸，核酸扩增检测仪扩增检测HBV、 HCV和 HIV靶序列，在Cobas S201系统服务器中自动判读结果，每组检测均设置质控对照（HBV/HCV/HIV-1-O/ HIV-1-M/ HIV-2），每个一级混样池均含内对照，全自动核酸提取、扩增检测系统检出的阳性一级混样池拆分为6个组，组成该一级混样池的原始标本做单标本检测，单标本检测阳性判定为NAT阳性，单标本检测阴性判定为NAT阴性。

1.5 确证实验

将NAT检测阳性的标本，再以另一种NAT试剂做单标本检测，乙肝五项（HBsAg、抗 -HBs、、HBeAg、抗 -HBe、抗 -HBc）送至北华大学附属医院用电化学发光法检测。

表1 NAT检测阳性标本分项确证试验

2 结果

2.1 NAT检测情况

经ELISA法筛查阴性的标本18 751份进行NAT检测，共筛查出阳性标本15份，阴性标本18 736份，阳性检出率为0.08%（因罗氏血筛试剂是HIV、HCV和HBV 3项联合检测，尚不能区分具体项目）。

2.2 NAT检测阳性标本分项确证情况

将Cobas S201系统检出的15份阳性标本用另一种核酸检测系统做确证试验，进行分项鉴别，其中有4份未检测到HBVDNA、HCV-RNA、HIV-RNA，11份标本检测出HBV-DNA阳性，阳性检出率为73.3%（11/15）。见表1。

3 讨论

本研究结果显示，18 751份阴性标本经Cobas S201系统检测后有15份为阳性，阳性检出率为0.08%。用确证检测系统进一步检测，结果阳性为11份，阴性4份。Cobas S201系统检测的病毒类型主要是HBV、HCV及HIV-1-O、HIV-1-M、HIV-2型，确证核酸检测系统检出的病毒型主要是HBV、HCV和HIV-1-O型，根据2个系统各自的工作原理，4份标本确证核酸检测系统未检出，不排除属于HIV-1-M、HIV-2型的可能[6]，又因笔者采用的是集中进行分项鉴别试验的模式，实验过程中标本保存须经过反复冻融或分装，病毒RNA对温度变化和环境中的RNA酶较敏感[7]相对比较容易降解，4份阴性标本不排除有这种可能性。对经分项鉴别试验确认的11份HBV阳性标本的乙肝五项检测，HBsAg虽阴性，但抗-HBe、HBeAg或抗-HBc阳性的标本共6份，其比率较高。据报道，我国普通人群和无偿献血人群的抗-HBe、HBeAg或抗-HBc的总体阳性概率为10%左右[8]，笔者统计的数据可认为是NAT阳性标本的病毒携带风险大于NAT阴性标本的原因。

Cobas S201系统为美国FDA批准应用于献血者的血液筛查系统，采用磁珠捕获的方法提取分离靶核酸片段，并以实时荧光PCR方法检测血液标本的核酸浓度。本实验NAT检测采用混样池检测模式，将6份常规检测阴性标本各取167 mL，混合至1个待测样本管进行检测，可以检测出较微量的HBV DNA、HCV RNA及HIV RNA，灵敏度较高。在HBV、HCV和HIV的检测中，HBV阳性检出率远远大于HCV和HIV，乙型肝炎是经血传播危害严重的病毒性传染病，每年新发病例50万[9]。目前在对乙肝病毒的筛查中，我国仍以HBsAg阳性与否作为筛查献血者HBV感染的指标，HBV感染后最先存在血清中是HBV DNA，就算用灵敏度较高的ELISA试剂检测抗原抗体也要经过50～80 d的“窗口期”[10]，因此ELISA方法对“窗口期”的漏检不能消除。在发达国家，如美国经过10多年利用NAT检测血液中的HIV和HCV，无偿献血者HCV RNA和HIV RNA阳性率下降至1/222 200和1/2 200 000[11]。自1993年起，欧美、日本以及我国香港等近20个国家和地区用NAT技术做献血者血液筛查，研究表明，通过NAT检测，可以将输血传播HBV、HCV和HIV的ELISA方法检测 “窗口期”分别缩短25、59和11 d[12]。

从笔者所在血站的实验数据分析可以看出，ELISA方法检测阴性的标本，用NAT系统检测后，仍有0.08%的阳性检出率，其他城市如北京、深圳、青岛、常州等血站的报道也阐明了NAT技术更为敏感的观点，可以筛查出尚属于“窗口期”的样本，能够大大提高输血安全系数。

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