赵晓冬，傅 蓉，王全一，李彦博

β-内酰胺类抗生素过敏反应的发生率与其高分子杂质的含量有关，在临床上最常见的不良反应是速发型过敏反应。引发β-内酰胺类抗生素速发型过敏反应的过敏原并不是β-内酰胺类抗生素本身，而是其中存在的高分子聚合物［1］。因此，对高分子聚合物的分析是当前β-内酰胺类抗生素质控研究的关键。注射用氨苄西林钠舒巴坦钠为《中国药典》2005年版(二部)收载品种［2］，该品种为含β-内酰胺酶抑制剂的复方抗生素。其主要活性成分氨苄西林的稳定性较差，有关物质中高聚物杂质所占比重较大，易形成氨苄西林的二聚、三聚、四聚和五聚物等高分子杂质，在动物实验中都显示出强烈的引发过敏反应性，但该品种项下却未规定高分子聚合物的检查项。采用《中国药典》2005年版中所载的葡聚糖凝胶Sephadex G10色谱系统［2］测定其中的高分子聚合物时，不能将氨苄西林聚合物与舒巴坦杂质有效分离，舒巴坦钠的出峰位置与β-内酰胺类抗生素聚合物相同，因此，无法测定该药物中的氨苄西林聚合物。笔者通过对其复方制剂中氨苄西林二聚物这一指示性高分子聚合物的分析，建立了简便、准确、灵敏和专属的HPLC法，以测定注射用氨苄西林钠舒巴坦钠中的高分子聚合物。

1 实验材料

1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱分析仪(安捷伦公司);AS5150超声波发生器(AUTO Research.Inc);CP225D电子天平(Sartorius公司);葡聚糖凝胶G10填充柱(上海药检所东方公司)。

1.2 试药与试剂 注射用氨苄西林钠舒巴坦钠(规格:1.5 g，批号:20090801，海口奇力制药股份有限公司);氨苄西林对照品(批号:130410-200706，85.7%)、舒巴坦对照品(批号:130430-200906，89.7%)、头孢拉定对照品(批号:130427-200306，91.8%)、葡聚糖2000均由中国药品生物制品检定所提供;磷酸二氢钾、磷酸二氢钠均为分析纯(国药集团化学试药有限公司);冰醋酸:分析纯(汕头市西陇化工厂);十二烷基硫酸钠:化学纯(辽宁省医药经贸公司试剂厂);乙腈:色谱纯(Concord Technology Co.Ltd)。

2 色谱条件及系统适用性试验

利用Sephadex G10凝胶色谱法和HPLC法［3］对注射用氨苄西林钠舒巴坦钠中高分子杂质的分离情况进行了比较。从图1-A可见，采用Sephadex G10凝胶色谱系统，舒巴坦杂质峰与氨苄西林聚合物峰在由葡聚糖2000定位的Kav=0的洗脱区间内重叠，使氨苄西林聚合物无法定量测定。但采用HPLC法，其中明确指出与主峰相对保留时间为2.8的为氨苄西林二聚物峰，见图1-B。因此，可以通过控制氨苄西林二聚物这一指示性杂质的含量，控制该药物中的高分子聚合物。最后确定色谱条件:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为12%醋酸溶液∶0.2 mol/L磷酸二氢钾溶液∶乙腈∶水(0.5∶50∶50∶900);流动相 B 为12%醋酸溶液∶0.2 mol/L磷酸二氢钾溶液∶乙腈∶水(0.5∶50∶400∶550)，检测波长:254 nm。先以流动相A-流动相B(85∶15)等梯度洗脱，待氨苄西林峰洗脱完毕后，立即按表1进行线性梯度洗脱。检测波长为254 nm。系统适用性试验①:取本品0.2 g，加水1.0 mL使其溶解，于60℃水浴中加热1 h，量取0.5 mL，置50 mL量瓶中，加流动相A稀释至刻度，取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，氨苄西林主峰保留时间约2.8倍处的较大杂质峰为氨苄西林二聚物峰;系统适用性试验②:另取舒巴坦对照品、氨苄西林对照品、头孢拉定对照品适量，加流动相A溶解并制成每1 mL中约含舒巴坦0.15 mg、氨苄西林0.3 mg、头孢拉定0.02 mg的混合溶液，取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，舒巴坦、氨苄西林、头孢拉定峰的分离度应大于3.0。

表1 梯度洗脱时间程序表

3 溶液的制备

取本品适量，精密称定，加流动相A溶解定量稀释，制成每1 mL约含氨苄西林钠2.7 mg的溶液，作为供试品溶液;另取氨苄西林对照品适量，精密称定，流动相A溶解定量稀释，制成每1 mL约含氨苄西林27 μg的溶液，作为对照溶液。

4 方法与结果

4.1 供试品中氨苄西林二聚物线性关系试验取本品加流动相，制成含氨苄西林13.50 mg/mL的溶液。再用流动相A稀释，制成含氨苄西林分别为 0.675、1.350、2.700、4.050、5.400 mg/mL 的系列溶液。各进样20 μL。以氨苄西林二聚物峰面积为纵坐标(Y)、氨苄西林钠进样浓度为横坐标(X)，得线性回归方程:Y=3.844 ×10 X-0.324 4，r=1.000 0。结果表明，氨苄西林在0.675～5.4 mg/mL范围内，与氨苄西林二聚物峰面积呈良好的线性关系。

图1 Sephadex G10凝胶色谱系统(A)、HPLC法系统适用性试验①(B)、HPLC法系统适用性试验②(C)注:1.氨苄西林高聚物;2.氨苄西林;3.舒巴坦杂质;4.舒巴坦;5.氨苄西林二聚物;6.头孢拉定

4.2 氨苄西林对照品线性关系试验 取氨苄西林对照品19.60 mg，加流动相A溶解并稀释至25 mL，摇匀，再加流动相 A稀释，制成含氨苄西林6.72、13.44、26.88、40.31、53.75 μg/mL 的系列溶液，各进样20 μL。以氨苄西林峰面积为纵坐标(Y)、氨苄西林进样浓度为横坐标(X)，得线性回归方程:Y=1.116 X －0.244 9，r=1.000 0。结果表明，氨苄西林在6.719～53.75 μg/mL范围内与氨苄西林峰面积呈良好线性关系。

4.3 氨苄西林二聚物峰的精密度试验 取本品加流动相A，制成含氨苄西林2.7 mg/mL的溶液。连续进样 5次，各进样 20 μL。结果 RSD为0.7%，说明本法精密度良好。

4.4 供试品溶液稳定性试验 取本品加流动相，制成含氨苄西林2.7 mg/mL的溶液，分别于放置0、1、2、4 h 时，进样 20 μL。结果表明，在 4 h 内，氨苄西林二聚物无明显变化，RSD为0.5%，表明供试品溶液中氨苄西林二聚物的稳定性良好。

4.5 供试品中氨苄西林二聚物的专属性试验进行如下破坏试验。①碱破坏试验:取本品45.46 mg，加0.1 mol/L氢氧化钠溶液 1 mL，放置 10 min，加0.1 mol/L HCl溶液1 mL，加流动相 A稀释至10 mL;②酸破坏试验:取本品45.55 mg，加1 mol/L HCl溶液1 mL，放置1 h，加1 mol/L氢氧化钠溶液1 mL，加流动相A稀释至10 mL;③热破坏试验:取本品45.33 mg，置称量瓶中，100℃烘箱中加热1 h，加流动相A溶解并稀释至10 mL;④氧化破坏试验:取本品45.39 mg，加过氧化氢溶液1.5 mL放置10 min，加流动相A溶解并稀释至10 mL;⑤光破坏试验:取供试品45.33 mg，置称量瓶中，摊平，254、365 nm紫外灯下照射24 h，加流动相A溶解并稀释至10 mL。各进样20 μL。结果表明，此色谱系统在各破坏试验中使其降解产物与氨苄西林、氨苄西林二聚物、舒巴坦均得到了较好的分离，除个别峰之外，绝大部分峰间的分离度大于1.5，认为此方法基本可行。

4.6 样品中氨苄西林二聚物检查 取本品适量，照“3”项下制成供试品溶液和对照溶液;取本品0.2 g，照“2”项下制成系统适用性试验溶液①;取舒巴坦对照品、氨苄西林对照品、头孢拉定对照品适量，照“2”项下制成系统适用性试验溶液②。照“2”项下色谱条件，各进样20 μL。由结果知，样品氨苄西林二聚物含量符合规定。色谱图见图2。

图2 氨苄西林二聚物检查供试品色谱图注:1.舒巴坦;2.氨苄西林;3.氨苄西林二聚物

5 讨论

5.1 由梯度洗脱方法分析复方制剂样品热降解溶液的色谱图(图1-B)可知，制剂中的主成分和各杂质均能得到较好的分离，且二聚物在此条件下为诸杂质中最大的杂质，有利于对氨苄西林二聚物峰位的确定。因此，热降解溶液可作为系统适用性溶液，以考量实际应用中方法的有效性。同时，可以与结构相似物头孢拉定之间的分离度作为系统适用性考察的另一指标(图1-C)。

5.2 采用主成分自身对照法时，在目前无法获得氨苄西林二聚物对照品的情况下，参考《英国药典》2008年版氨苄西林有关物质中对氨苄西林二聚物的相关限度，制定为“氨苄西林二聚物峰面积不得大于对照溶液主峰面积的4.5倍(4.5%)”。

［1］ 赵晓冬，傅蓉，毕开顺.分子排阻色谱法测定注射用头孢呋辛钠舒巴坦钠中的高分子杂质［J］.药物分析杂志，2010，30(1):95-98.

［2］ 中国药典［S］.二部.2005:786-787，(附录)35-36.

［3］ British PharmacopoeiaCommission.British Pharmacopoeia 2008［S］.London:The Stationery Office，2008:155-158.