张玉贵 (四川省水产学校合川校区,重庆合川401 520)

胡 波 (四川省水产学校郫县校区,四川郫县611 730)

黄晓莉,汪开毓 (四川农业大学兽医院,四川 雅安62501 4)

随着鲟鱼养殖技术的普及推广,我国的鲟鱼养殖得到快速发展,鲟鱼养殖品种呈现多样化,产量也越来越高,目前已经跃居世界第一。笔者在对四川的鲟鱼养殖基地的调查中发现,随着养殖密度的加大,加之鲟鱼对于水体温度的特殊性要求,在养殖过程中也面临一些问题。鲟鱼疾病也成为一个不容忽视的问题,特别是杂交鲟 (西伯利亚鲟Acipenserbaerii♂×施氏鲟A.schrenckii♀)的体表溃烂现象较为常见 (暂定为体表溃疡病)。为了为该病的诊断、预防与治疗提供依据,笔者对该病的病原学和药物敏感性作了初步研究,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

病鱼为采自四川彭州新兴镇日兴特种养殖场所养殖的杂交鲟,每尾体重平均为595.5g。病鱼的体表多处出现明显的开放性溃疡。健康鱼为购自四川鲟鱼养殖基地的健康杂交鲟,每尾体重平均为52.5g。健康鱼饲养在120cm×80cm×50cm的玻璃缸中,饲养采用完全曝气的自来水,24h连续增氧,试验前暂养1周,暂养期间投喂颗粒浮性饵料,试验过程中不投饵料。

1.1.2 主要培养基

采用细菌分离常用的标准培养基:普通营养琼脂平板、胰酪胨大豆琼脂肉汤 (TSB)、血清肉汤培养基、血清琼脂平板。

1.1.3 主要试剂

生理盐水、分子生物学鉴定试剂、大肠杆菌JM 109、PCR扩增的上游引物为5'-GAGCGGATAACAAT TTCACACAGG-3',下游引物为5'-CGCCAGGGTT T TCCCAGTCACGAC-3'、HE染色主要试剂、10%中性福尔马林固定液、伊红染液、水乙醇、二甲苯、石蜡、冰醋酸、明矾、氧化汞、中性树脂胶、20%戊二醛、20%戊二醛+20%新洁尔灭。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的分离

取发病症状典型的病鱼,用无菌生理盐水冲洗病鱼体表,在无菌条件下,用接种环分别挑取病鱼溃烂灶边缘的肌肉,以及病鱼的肝脏、脾脏、肾脏接种TSB肉汤;将接种后的TSB肉汤放入水浴振荡器中120r/min、28℃下培养24h后观察细菌生长状况,然后将带菌肉汤在TSA平板上划线培养,挑取单个菌落,显微镜镜检后进行细菌的纯培养[1]。

1.2.2 回归感染试验

选择在实验室水族箱中暂养1周以上的健康杂交鲟,每10尾1组。将分离纯化培养的菌株分别接种TSA平板,培养24h后,用无菌生理盐水洗下菌苔,制成3.0×108cfu/ml的菌悬液,分别进行注射感染、创伤感染和浸泡感染。其中,注射感染:肌肉注射0.1ml/尾菌悬液,对照组注射0.1ml/尾的无菌生理盐水;创伤感染:将试验鱼体表人为划破,浸泡在细菌悬液中,对照组浸泡于无菌生理盐水中,浸泡感染:将体表无损伤的健康试验鱼,浸泡在细菌悬液中,对照组浸泡于无菌生理盐水中。观察7d,并记录试验鱼的发病情况。

1.2.3 病原菌的鉴定

(1)病原菌的形态观察 单个菌落接种于TSB肉汤,28℃培养18h后取菌液,经涂片、固定和革兰氏染色,显微镜观察。

(2)生理生化试验 将细菌接种于 TSA平板和鲜血平板上观察其菌落形态和生长情况,将培养24h斜面上的细菌采用穿刺发接种于微生物生化鉴定管中,28℃恒温培养24h后观察结果[2]。

(3)16S rDNA基因克隆及测序 分离菌株种的鉴定采用16S rDNA基因特异性扩增法进行,分别以细菌核酸提取液和菌细胞悬液为模板进行PCR扩增[3]。取对数生长期的新鲜菌液,离心收集菌体,提取基因组 DNA。PCR 反应体系 (50μ l):5μ l 10 ×buffer,4μ l dNTP,2μ l primer,5μ l模版,4μ l 25nmol Mg2+,0.4μ l Taq酶,加水至 50μ l。PCR反应条件:首先 94℃变性 5min,然后进入参数为 94℃1min,54℃1min,72℃2min的循环,共30个,最后72℃延伸10min。经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测其扩增片段大小应在1500bp左右。PCR产物经DNA纯化试剂盒纯化,克隆到pMD18-T载体中后测序[4]。

(4)系统进化树分析 将测序所得16S rDNA的互补DNA序列,与GenBank数据库中的已知核酸序列进行Blast分析,调出与该序列相关性较高的核酸序列,采用DNAStar软件的Multiple Sequence Alignment程序进行多序列比对和系统发育树构建[4]。

1.2.4 药敏试验

将纯化培养24h的细菌以无菌生理盐水洗下,制备成细菌悬液,取0.1ml菌液涂布于TSA平板。将抗生素纸片 (7mm)贴于平板表面,28℃恒温培养24h后观察其抑菌圈的有无及直径大小。根据抑菌圈直径判断标准[5],判断菌株对药物的敏感性结果 (抑菌圈越大表明敏感性越强)。用游标卡尺测量抑菌圈的大小并作好记录。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离鉴定

经常规细菌分离,得到一疑似致病菌株,命名为K070401菌。该菌株在TSA平板上生长呈边缘光滑、有光泽的圆形白色菌落,显微镜下为革兰氏阴性短杆菌。该菌葡萄糖氧化发酵阳性,氧化酶检测阳性,0%NaCl生长,脂酶阳性。能利用甘露醇,具运动性,能发酵麦芽糖,不产生H2S,葡萄糖产酸阳性,葡萄糖产气阳性,精氨酸双水解酶阳性,DNA酶阳性,鸟氨酸脱羧阴性,还原硝酸盐。

2.2 致病菌的动物回归感染试验

通过肌肉注射、划痕浸泡和浸泡感染3种方式对健康鱼进行人工感染,结果发现,肌肉注射和划痕浸泡都能引起试验鱼发病,而浸泡感染不引起鱼发病。人工感染24h后可观察到体表创面面积明显增大;44h后观察到溃疡的出现,创面处的皮肤部分脱落,肌肉明显充血;53h后观察到溃疡进一步扩大,创面处的皮肤几乎全部脱落,严重充血的肌肉暴露。解剖检查,肾脏轻微肿大,并可见轻微肠炎,其他脏器无明显变化。在无菌条件下,从人工感染发病的鲟鱼病灶周围肌肉和肝脏中分离到与K070401株形态与生化特性一致的相同的病原细菌,表明K070401株是鲟鱼皮肤溃烂病的致病菌病原。

2.3 K070401菌株16Sr DNA的PCR扩增结果与系统发育分析

PCR扩增出K070401菌株的16S rDNA片段经琼脂糖电泳检测表明,其大小约 1500bp(图1)。将获得的序列用DNAstar软件进行多序列比对分析和构建系统发育树(图2),结果表明K070401菌在系统发育数上与嗜水气单胞菌聚为一簇,同源性最高为99.2%(图3),结合形态学和理化特征鉴定其为嗜水气单胞菌 (Aeromonashydrophila)。

图1 分离菌株K070401的16S rDNA的PCR扩增产物的电泳图谱

图2 K070401菌株及相关嗜水气单胞菌株的系统进化树

2.4 药敏试验

药敏试验结果详见表1。由表1可知,磺胺异噁唑、洛美沙星、阿奇霉素的抑菌圈直径分别为20、22、24mm,表现为高度敏感 (抑菌圈直径大于20mm);克拉霉素、强力霉素、链霉素、美满霉素抑菌圈直径15～18mm,表现为敏感 (抑菌圈直径大于15mm);氨苄青霉素、万古霉素、阿莫西林无抑菌圈,表现为不敏感,有耐药性。

3 小结

表1 K070401的药敏试验结果

(1)本研究从杂交鲟体表溃疡旁侧的肌肉分离得到1菌株,革兰氏染色为阴性,镜检下呈短杆状,两头钝圆,大多数细菌单独存在,少数细菌成对甚至成链存在。菌落 1.5～2.0mm,边缘光滑,凸起,半透明。该菌葡萄糖氧化发酵阳性,氧化酶检测阳性,0%NaCl生长,脂酶阳性。能利用甘露醇,具运动性,能发酵麦芽糖,不产生 H2S,葡萄糖产酸阳性,葡萄糖产气阳性,精氨酸双水解酶阳性,DNA酶阳性,鸟氨酸脱羧阴性,还原硝酸盐。K070401株形态、生化特性与嗜水气单胞菌标准菌株一致。

(2)应用细菌通用引物,扩增出K070401菌株的16SRNA的互补DNA片段,该片段大小为1591bp。经与其他细菌比对,通过同源性分析比较与嗜水气单胞菌标准菌株的同源性高达99.2%,最终鉴定为嗜水气单胞菌。

(3)通过动物回归感染试验,用分离的菌株获得相同病灶特征的病鱼,可以基本确定K070401菌株是体表溃疡病的致病菌。

(4)药敏试验结果表明,该菌对罗美沙星、磺胺异噁唑、阿奇霉素敏感;对克拉霉素、强力霉素、链霉素、美满霉素较敏感;对氨苄青霉素、万古霉素、阿莫西林不敏感。该菌不同类型的抗生素的敏感性有较大差异,因而在防治该类疾病的过程中要有选择性。

[1]毛芝娟,刘国勇,陈昌福,等.大黄鱼溃疡病致病菌的初步分离与鉴定[J].安徽农业大学学报,2002,29(2):178-181.

[2]陈雅芳,王 军,苏永全,等.养殖石斑鱼溃疡病病原哈维氏弧菌胞外产物的研究 [J].海洋科学,2006,30(10):30-34.

[3]Weisbnrg W G,Bams S M,Pelletier D A,et al.16S rDNA amplification for phylogenetic study[J].J Bacteriol,1991,173:696-703.

[4]陈 偿,胡超群,陈晓燕,等.新发现的红拟石首鱼溃疡病病原海藻施万氏菌的分离和分子鉴定[J].海洋与湖沼,2003,34(1):1-8.

[5]苏秀梅.泥鳅体表溃疡症的防治 [J].科学养鱼,2006,(11):55.