黄 俭 陈志伟 王军峰

1.上海高镜镇社区卫生服务中心，上海 200435；2.上海执诚生物技术有限公司，上海 201204

近年来研究表明胱抑素C（Cys c）在评估肾小球过滤速度（GFB）中优于血肌酐，Cys c在检测方法上已从非均相法发展到自动化快速均相检测法，颗粒增强透射免疫比浊法是以多克隆抗体为基础的改良免疫比浊分析法，整个分析过程只需几分钟，可利用生化分析仪进行比浊测定，这些研究为Cys c在临床广泛应用奠定了基础[1-2]。溯源是通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准，通常是与国家标准或国际标准联系起来的特性[3]。用于体外诊断的医学器具，欧盟指出“溯源性”为具体的必备条件之一[4]。因此对体外诊断试剂进行溯源性分析是必然的趋势。

测量不确定度表示指南（GUM）[5]是由国际标准化组织（ISO）、国际电工委员会（IEC）、国际计量局（BIPM）、国际法制计量组织（OIMI）、国际理论化学与应用化学联合会（IUPAC）、国际理论物理与应用物理联合会（IUPAP）、国际临床化学联合会（IFCC）等7个最具权威性的国际学术团体联合公布的标准。我国在1999年将其等同转换为国家标准，编号为JJF1059-1999[6]。根据这一标准测量不确定度的定义是：表征合理赋予被测量之值的分散性，与测量结果相联系的参数。为了使IVD试剂溯源过程更加容易理解，使溯源过程更具可操作性，本研究在不违背原定义的情况下将其解释为：在某概率下，测量值的估计区间与真实值的估计区间之间最大的差距。这一差距涵盖了被测量值的分散性，分散性越大不确定度越大。

目前溯源理论和技术已经成熟，有很多研究可以借鉴[7-8]。但是体外诊断试剂又有其特殊性，因为在进行分析之前，首先要对测量系统进行校准（定标），以消除系统误差。然而，定标品存在的不确定性，往往被人们忽略。本研究正是考虑了这一实际情况，并结合胱抑素C试剂盒定标的特点，提出了一个比较合适的方法用来评估定标过程引入的误差，从而使试剂的不确定度更加完整。

1 材料与方法

1.1 仪器

紫外可见分光光度计（型号：日本岛津2450）；BioRAD移液枪（20 μL）；Appendof移液枪（200 μL）；Appendof移液枪（1000μL）

1.2 试剂

胱抑素C（胶乳颗粒增强免疫比浊法）试剂盒（DENUO）；胱抑素C定标品（denka seiken co.，LTD），其不确定度由厂商提供。见表1。

表1 胱抑素C试剂盒定标品含量及其不确定度

以上定标品的不确定度可溯源至 DAKO Cytomation CystatinC Calibrator（product code：X0974， Cys-c 7.5 mg/L）。

1.3 溯源方法

不确定度计算过程一般包括：定义模型以确定输入和输出参数之间的关系；确定输入量Xi的估计值xi；评估xi的不确定度u（xi）；计算输出量和与之关联的不确定度；计算扩展不确定度；输出测量结果。其中不确定度传递见公式1。

2 结果

2.1 完成定标曲线

取5个校准品和水进行6点定标：以OD值为横坐标，以已知的胱抑素C浓度为纵作标，制成标准曲线。见图1。为了计算定标过程的不确定度，笔者对定标品重复取样5次，并进行测量，因此每点是5个取样值的平均。由图1可知，使用4次非线性回归可以取得最好的效果，拟合常数R=0.9998。拟合方程的形式为公式1。

2.2 校准模型不确定度的估计

通过统计软件，一方面可以完成对曲线的拟合，计算出模型参数值，同时也可以给出参数估计值范围和模型期望值范围。见表2、图2。

图1 胱抑素C浓度与吸光值关系图

表2 输入参数及其不确定度（μL）

图2 胱抑素C浓度与OD关系

软件计算出来的误差范围很大，是因为不能给软件提供最精练的计算公式，因此它会反复迭代利用输入参数，导致参数和模型的不确定度呈几何放大，因此软件计算出的不确定度与实际情况不符合。为了在溯源过程中能够考虑校准过程带来的不确定度，笔者提供了一个比较简单的估算方法：首先计算每个定标点的5个重复值的浓度估计区间和吸光值的估计区间（本研究都是在α=0.05时进行区间估计），这样就得到了6组区间值，然后分别使用6组的最小值和最高值两两组合，进行曲线拟合，这样便可得到4组拟合参数。见表3。之后将测量的吸光值分别代到这4个方程中，这样计算出的浓度便是在4种可能的定标模型下的结果。然后再对这些可能的浓度进行区间估计。最后计算样品区间与可能的真值区间之间最大的距离，这个最大距离就是在α=0.05时样品浓度的分布范围，既不确定度。参考值区间可以通过计算定标品和仪器引入的误差进行计算。见表4。

2.3 试剂测量总不确定度估计

在试验中笔者通过混合校准品得到胱抑素C浓度为1.0 mg/L混合“标准品”，再对其进行5次检测。然后计算这些值的估计区间，再将区间上限和下限代入以上4个公式，计算出8个检测值，然后对这8个值进行区间估计，得到计算值的范围。见表5。

表3 定标模型参数拟合值

表4 校准品经过处理后的浓度范围（mg/L）

表5 总不确定度及扩展不确定度计算结果

因此，本试剂在测量1.0 mg/L样本时的扩展不确定度为12.8%。

根据以上溯源方法，笔者对另外一批胱抑素C试剂进行了溯源：混合样本理论浓度为0.75和4.5 mg/L时，测量结果的扩展不确定度分别为15.0%和4.8%。结果表明，试剂在不同浓度下的不确定度是不同的，主要是因为不同的样本误差不同，另外定标品的误差传递到定标曲线上，在定标曲线上不同的位置会有不同的不确定度。

3 讨论

3.1 模型成立假设条件

①纯水中不含有胱抑素C；②在溯源过程一些条件，如温度、湿度、压力基本符合要求，整个测量过程时间较短，假设这些因素的波动不引入随机误差；③由于在测量之前对系统进行了校准，因此系统误差会显著降低，本研究假设系统误差为0。

3.2 定标曲线对测量结果的影响

在溯源过程中如果不考虑定标曲线模型对计算结果的影响，必然对溯源的可靠性带来不利影响，使计算的不确定度偏低。本研究分析了软件提供的误差与实际存在很大差距的原因是数据的反复迭代使用，因此很难直接计算出模型参数的误差。在这样的环境下，本研究提供了一个操作性很强的用于估计校准过程引入误差的方法，通过使用这一方法笔者完成了胱抑素C的溯源性分析。

3.3 试剂测量过程的不确定度

试剂的不确定度反映了分析结果的分散性，本研究将其解释为：在某概率下，可能的测量值与可能的真实值之间最大的差距，这一阐释在没有违背原定义的情况下，使溯源过程更加容易理解，增强了IVD试剂溯源过程的可操作性。试验证明测定不同浓度的样本，不确定度会不同，这并不能说明被检试剂性能不稳定，因为这个差距往往来自于不确定度互不相同的定标品之间。另外仍需说明，某次的溯源结果并不能代表整个试剂全部使用过程的不确定度，因为操作不同，使用的仪器不同，使用的定标方法不同，都可能引入大小不一的误差。

综上所述，本研究提出了一个适用于解决体外诊断试剂溯源的方法，实践证明，本研究提供的方法增强了IVD试剂溯源过程的可操作性。

[1]蔡钢强，垢敬，焦连亭.血清胱抑素C浓度判断肾小球滤过功能的应用评价 [J].临床检验杂志，2002，20（3）：159-160.

[2]张翀，丁进芳，韩平治.胱抑素C的检测方法及临床应用进展[J].中国医学检验杂志，2004，5（8）：330-332.

[3]Medical laboratories.Particular requirements for quality and competence[J].International Standard ISO 15189，2003：1-4.

[4]In Vitro diagnostic medical devices. Directive 98/79/EC of European Parliament and of the Counlil of 27 ctober 1998 on in ritro diagnostic medical devices[S].official Joumal 331,1998-07-12.

[5]ISO/IEC Guide 98.ISO standard A Guide to Expression of Uncertainty in Measurement[S].2008..

[6]杨振华.关注测量不确定度在临床检验中的应用[J].中华检验医学杂志，2007，30（5）：965-966.

[7]莫姿丽，黄诺嘉.紫外分光光度法测定维生素B1片含量的不确定度分析[J].海峡药学，2009，21（3）：87-89.

[8]毛如增，冯典英.化学计量中的不确定度[J].化学计量,1997，6（5）：11-13.