张德利 徐贝贝 李春辉

承德医学院附属医院病理科，河北 承德 067000

胃癌（gastric carcinoma）是我国常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率居各类肿瘤的首位，然而关于胃癌的发病机制目前尚未明确，因此胃癌的发生和发展的研究即发病机制的研究就成为了目前的研究重点。微管相关蛋白（microtubule associated protein，MAP）是结合于微管上的非微管结构蛋白，目前，已发现和提纯的MAP主要有MAP-1、MAP-2、MAP-4和Tau蛋白等几种[3]。它们参与微管的组装，维持微管的稳定和微管与其他骨架纤维间的连接，表现出广泛的功能性作用。Tau蛋白即微管聚合蛋白与微管结合，能诱导微管成束，增强微管的稳定性[4]。Tau蛋白是细胞骨架的重要成分，细胞骨架发生异常变化，从而造成细胞黏附能力下降，运动能力增强等，引起细胞恶性转化为肿瘤细胞，导致肿瘤的发生，Tau是有丝分裂期纺锤体的主要成分，它可使肿瘤细胞周期顺利进行，为肿瘤细胞无限增殖提供条件，加速恶性肿瘤的进展。关于Tau蛋白在胃癌中的免疫组织化学的研究国内外已经有报道，然而关于Tau mRNA在胃癌中的表达及与临床病理间的关系的研究目前未见报道。

1 材料与方法

1.1 临床资料

标本的收集：收集承德医学院附属医院2008年12月～2010年3月手术切除病变组织及正常胃组织（距离肿瘤10 cm以上认为正常胃组织），组织厚度＞4 mm，标记后立即投入液氮中保存，其中胃癌组织标本60例，正常胃组织10例。60例胃癌患者中，男49例，女11例，年龄43～77岁，平均（58.3±10.0）岁；高中分化者28例，低分化者32例；无淋巴结转移者25例，有淋巴结转移者35例。

1.2 材料与仪器设备

Trizol试剂，异丙醇，乙醇；AMV反转录试剂和盒，PCR扩增试剂盒，琼脂糖，溴化乙锭（EB），超速离心机，Bio-mini紫外分光光度计，PCR扩增仪，2020D凝胶成像系统等。

1.3 实验方法

1.3.1 RNA组织的提取 研钵先预冷，将组织从液氮罐中取出放入研钵中细磨，每例标本质量控制为100 mg，边研磨边加液氮，组织研磨至粉末状后加入Trizol试剂1 mL，将其用钥匙击碎，移入1.5 mL的EP管内于室温下融化，静置5 min后在4℃的温度下进行10 min离心12000 g。上清移置新EP管内，加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡15 s后于室温静置5 min，4℃的温度下进行10 min离心12000 g，移取约200μL的上层水相到新的1.5 mL EP管中，待RNA沉淀完，加入约200μL的异丙醇，颠倒混匀10余次，室温沉淀10 min后4℃的温度下进行10 min离心12000 g，弃去上清液，加入1 mL预冷的78%的乙醇，4℃进行5 min离心7500 g，RNA洗涤2次；弃上清液，溶解RNA，10～15 min的空气干燥后加入20μL DEPC水，57℃水浴孵育10 min。

1.3.2 RNA的检测 采用琼脂糖凝胶电泳方法来检测RNA的完整性；1%琼脂糖凝胶用Tris-乙酸（TAE）配制，加电泳缓冲液Tris-乙酸（1×TAE），每加样孔加4μL RNA样品，进行 40 min 60 V的电泳；分光光度计检测，波长设定230 nm、260 nm、 280 nm，分别测定RNA样品在设定波长时的OD值，计算OD260/OD280，检测RNA的纯度及浓度。

1.3.3 反转录过程 在冰浴的管中加入如下组分：RNA 1000 ng，Oligo（dT）15（0.05μg/μL）1μL，无RNA 酶水定容至11μL，轻轻混匀后离心3 s；反应混合物在放于PCR仪中70℃5 min，立即置于冰上，冰浴30 s，离心3 s；在试管中加入如下组分 5×Reaction Buffer 4μL，RNase Inhibitor（20 U/μL）1μL，dNTP Mix（10 mmol/L）2μL，混匀，离心，放于 PCR 仪中 37℃，5 min，冰浴 30 s，离心 3 s；加入 AMV RT（10 U/μL）2μL，终体积 20μL，放于 PCR 仪中 37℃，60 min；70℃ 10 min结束反应，置于冰上进行后续实验。

1.3.4 聚合酶链反应（PCR）Tau上游引物（5’to 3’）：GTGACCCAAGAGCCTGAAAGT；Tau下游引物（5’to 3’）：GGTGCAGGTCTCCTAGAAGC；50 bp DNA Ladder购自北京天根生化有限公司（MD108）。冰浴中，在管中加入如下组分：上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，cDNA模板（500 ng-1μg/μL）1μL，加ddH2O至25μL，β-actin循环设置：95℃预变性5 min；95℃变性 45 s，58 ℃退火 45 s，72℃延伸 30 s，循环 31 次；72℃最终延伸10 min结束反应。产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

E-cad循环设置：95℃预变性 5 min；95℃变性 45 s，60℃退火45 s，72℃延伸30 s，循环40次；72℃最终延伸10 min结束反应。产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

Tau循环设置：95℃预变性5 min；95℃变性45 s，69℃退火45 s，72℃延伸30 s，循环40次；72℃最终延伸10 min结束反应。产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

1.3.5 RT-PCR检测 Tau mRNA琼脂糖凝胶电泳结果分析，取PCR产物10μL用1.5%琼脂糖凝胶电泳，经EB染色后，在紫外荧光数字成像仪下照像并进行光密度定量分析。以每例E-cad和Tau蛋白分别与其相应β-actin扩增产物条带累积光密度（IOD）的比值作为E-cad mRNA和Tau mRNA的相对表达量。

1.4 统计学处理

实验资料的统计学处理通过SPSS11.5统计软件完成，计量资料用（）表示，采用两独立样本 t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结论

2.1 正常胃组织与胃癌组织中Tau mRNA的表达

10例正常胃组织Tau mRNA的相对含量为（0.53±0.01）；60例胃癌组织 Tau mRNA 的相对含量为（0.78±0.08）， 胃癌组织Tau mRNA的相对含量明显高于正常胃组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）；高中分化者Tau mRNA的相对含量为（0.70±0.03）；低分化者Tau mRNA的相对含量为（0.86±0.02），低分化者Tau mRNA的相对含量明显高于高中分化者，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。Tau mRNA在正常胃组织中的表达见图1。

表1 Tau mRNA在正常胃组织以及胃癌组织中的表达（）

表1 Tau mRNA在正常胃组织以及胃癌组织中的表达（）

组别 n IOD P正常胃组织 10 0.53±0.01＜0.05胃癌 60 0.78±0.08分化程度高中分化 28 0.70±0.03＜0.05低分化 32 0.86±0.02

2.2 胃癌组织中Tau mRNA的表达与临床病理指标间的关系

60例胃癌组织中无淋巴结转移者Tau mRNA的相对含量为（0.74±0.07）；有淋巴结转移者Tau mRNA的相对含量为（0.81±0.08），有淋巴结转移者Tau mRNA的相对含量明显高于无淋巴结转移者差异具有统计学意义（P＜0.05），TNM分期Ⅰ+Ⅱ期Tau mRNA的相对含量为（0.16±0.17），Ⅲ+IV期Tau mRNA的相对含量为（0.33±0.19），Ⅲ+IV期 Tau mRNA的相对含量明显高于Ⅰ+Ⅱ期（P＜0.05），Tau mRNA含量在不同年龄、性别、病变长度中差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。Tau mRNA 在高中分化胃癌中的表达见图2。Tau mRNA在低分化胃癌中的表达见图3。

表2 不同临床病理特点胃癌组织中Tau mRNA的表达（）

表2 不同临床病理特点胃癌组织中Tau mRNA的表达（）

组别 n IOD P年龄（岁）＞0.05≤60 33 0.29±0.11＞60 27 0.35±0.20性别男49 0.26±0.13 ＞0.05女11 0.26±0.12大小≤5 cm 37 0.24±0.17 ＞0.05＞5 cm 23 0.21±0.18淋巴转移未转移 25 0.74±0.07 ＜0.05转移 35 0.81±0.08 TNM分期Ⅰ+Ⅱ期 32 0.16±0.17 ＜0.05Ⅲ+Ⅳ期 28 0.33±0.19

图1 Tau mRNA 在正常胃组织中的表达

图2 Tau mRNA 在高中分化胃癌中的表达

图3 Tau mRNA在低分化胃癌中的表达

3 讨论

微管结合蛋白（microtubule associated proteins，MAPs）分子至少包含一个结合微管的结构域和一个向外突出的结构域。突出部位伸到微管外与其他细胞组分，MAP的主要功能：①促进微管聚集成束；②增加微管稳定性或强度；③促进微管组装。包括Ⅰ型和Ⅱ型两大类，Ⅰ型对热敏感，如MAP1a、MAP1b，主要存在于神经细胞。Ⅱ型热稳定性高，包括MAP2a、b、c，MAP4和Tau蛋白。细胞内微管蛋白分为α、β两个亚型，是细胞骨架的重要组成部分，它担负着维持细胞形态，进行物质交换，传递信息，参与有丝分裂等的重要功能，微管蛋白是真核细胞中普遍存在的结构，中心体异常和染色体不稳定是肿瘤细胞的普遍特征，中心体微管蛋白较其他功能微管蛋白随细胞周期变化活跃。有研究表明癌细胞的中心体数目多，具有更强的微管成核能力，中心体异常更为显著。许多研究表明肿瘤中Tau表达增加，Tau表达的增加，则会加快肿瘤的生长加速，而促进肿瘤的发生发展，关于Tau蛋白的研究多倾向于神经系统[5-8]，胃癌中未见涉及，但笔者从它的生物学功能可以看出，Tau蛋白与微管结合，能诱导微管成束，增强微管的稳定性，微管是有丝分裂期纺锤体的主要成分，它可使细胞周期可以顺利进行，为癌细胞无限增殖提供条件[9-10]。Tau蛋白正是辅助微管的这种作用，加速恶性肿瘤的进展。任峰等[11]通过实时定量PCR、细胞增殖实验、流式细胞技术等探讨胃癌细胞的Tau基因表达与紫杉醇治疗敏感性间的关系。结果显示：紫杉醇对Tau基因表达低的胃癌细胞具有更强的增殖抑制作用，且更能促进其凋亡，提示Tau蛋白在胃癌组织中可能表达增高，这一结果同笔者的研究结果相同。笔者的实验结果显示Tau mRNA在正常胃组织中的表达低于在胃癌组织中的表达，高中分化胃癌组织Tau mRNA的表达低于低分化胃癌组织，无淋巴结转移胃癌组织Tau mRNA的表达低于有淋巴结转移胃癌组织，且差异有统计学意义（P＜0.05），且与胃癌的分化程度和淋巴结转移有关，提示Tau在胃癌组织的mRNA水平出现异常，与肿瘤的分化程度，有无淋巴结转移有关。笔者对正常胃组织及胃癌组织中Tau mRNA进行研究，这对于了解胃癌的发生机制及预后的判断，都具有重要的参考意义，同时随着微管的性质和功能不断地被阐明，抗肿瘤活性是否也来自于微管抑制剂对其动态不稳定性的影响尚需深人研究，微管仍是抗肿瘤药物研究的一个热门靶点，也必定会产生更多的有显著抗肿瘤作用的微管抑制剂。

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