周 枫

江西中医学院科技学院药学系，江西 南昌 330025

RMP（RPB5-mediating protein）是RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ，RNAP Ⅱ）第5亚基RPB5的调节蛋白，其通过与RPB5的特异性结合来调节RNAPⅡ的转录活性，调节多种基因的转录和表达[1-2]。RMP最早于1995年由Cheong等采用Far-Westen印迹法，以32P标记的重组人RPB5探针从人肝癌细胞株的cDNA文库中筛查得到[3]。目前已有研究表明：RMP是一个重要的转录因子，在基因转录、细胞凋亡、基因组稳定以及肿瘤发生发展中均可能起重要作用[4]。笔者通过合成RMP基因的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）真核表达载体，转染到肝癌SMMC-7721细胞中，研究RMP基因对肝癌细胞稳定性及迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

SMMC-7721肝癌细胞株从苏州大学医学部细胞生物学系实验室购买；G418从Sigma-aldrich公司购买；RT-PCR试剂盒从Fermenant公司购买。RPIM1640培养液和小牛血清从Gibco公司购买。

1.2 方法

将肝癌SMMC-7721细胞等量分为实验组与对照组，分别置于含15%小牛血清的RPIM1640培养液中，将其放入7.5%CO2的培养箱中以37℃恒温培养24 h。分离出处于对数生长期的细胞进行实验。向实验组中加入2 mL含6μg转染液，在相同条件下继续培养24 h。用G418筛选实验组中干扰RMP基因的细胞株。共72 h后，RT-PCR检测实验组与对照组RMP、p21 mRNA的表达情况。用Bandscan软件测出两组细胞能RMP/GAPDH和p21/GAPDH的灰度值（%）做比较。用体外划痕法检测两组细胞的迁移能力。

1.3 统计学处理

2 结果

RT-PCR结果显示实验组RMP表达水平比对照组明显下降，实验组p21mRNA水平也显著低于对照组，说明干扰RMP基因降低了p21的表达，p21对维持DNA的稳定性起重要作用，说明RMP基因有维持细胞基因稳定性的作用。用体外划痕法比较实验组与对照组的细胞迁移能力，发现实验组的划痕宽度高于对照组，说明实验组细胞的迁移能力明显低于对照组，RMP基因对保持细胞的迁移能力有重要作用。见表1。

3 讨论

肝癌是死亡率仅次于胃癌、食道癌的第3大常见恶性肿瘤，目前正严重影响着越来越多的国人的生活质量。RMP作为一种重要的转录因子，在基因组稳定、细胞运动、肿瘤发生发展中均可能起到重要作用。如何确定RMP基因对肝癌细胞稳定性以及迁移能力的影响，成为笔者研究的方向。

表1 两组RMP/GAPDH与p21 mRNA/GAPDH的灰度值及划痕宽度比较（）

表1 两组RMP/GAPDH与p21 mRNA/GAPDH的灰度值及划痕宽度比较（）

组别 RMP/GAPDH（%）p21mRNA/GAPDH（%） 划痕宽度（d/μm）实验组 26.58±2.31 45.78±4.35 208.71±12.43对照组 39.61±3.17 78.23±3.21 69.61±8.87 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

在本研究中，笔者将合成的小干扰RNA成功转染到SMMC-7721肝癌细胞中，筛选出稳定表达的细胞株作为实验组。利用RT-PCR技术检测发现，与对照组相比，实验组细胞RMP基因表达水平明显降低（P＜0.05），而且实验组p21 mRNA水平也显著低于对照组（P＜0.05），说明RMP基因被干扰以后，能相应减弱p21 mRNA的表达水平，而p21基因对细胞周期调控有重要作用，那么RMP基因对维持细胞稳定性也能起到一定作用。通过体外划痕试验，笔者发现实验组的划痕宽度显著高于对照组（P＜0.05），说明成功干扰RMP基因的细胞株的迁移能力下降，提示RMP基因在保持细胞的迁移能力中也有重要作用，其中体外划痕实验的结果与连晓宁等[4]的研究结果一致。

综上所述，笔者认为RMP基因与肝癌的发生、发展有一定联系，并且RMP基因对维持肝癌细胞的稳定性起重要作用，可能是和p21基因协同调控肝癌细胞的细胞周期，还能保持细胞的迁移能力，为肝癌的基因治疗提供了新的研究方向。

[1]Delgerma L, Hayashi N, Dorjsuren D, et al.Subcellular localization of RPB5-mediating protein and its putative functional partner[J].Mol Cell Biol, 2008,24(19):8556-8566.

[2]Cramer P, Bushnell DA, Fu J, et al.Architecture of RNA polymeraseⅡ and implic- ations for the transcription mechanism[J].Science, 2007, 288(5466):640-649.

[3]Cheong JH, Yi M, Lin Y, et al.Human RPB5, a subunit shared by eukaryotic nuclear RNA polyerases，binds human hepatitis B birus X protein and may play a role in X transactivation[J].EMBO J, 2008, 14(1):143-150.

[4]连晓宁，杨慧翠，曹锴，等.RMP siRNA对SMMC-7721肝癌细胞增殖和迁移能力的影响 [J].肿瘤，2010，30（1）：15-20.