孙 燕，冯 斌，龙运然，戴甲培*

(1中南民族大学武汉神经科学和神经工程研究所，武汉430074;2中南民族大学药学院，武汉430074)

七十味珍珠丸(RNPS)是传统藏药大组方药品的典型代表，其主要功能为安神、镇静、通经活络、调和气血和醒脑开窍.经过长期(数百年)的临床实践证明，RNPS对血压失调和心肌梗塞、脑动脉硬化、脑血栓、脑卒中及其后遗症(半身不遂、瘫痪)、癫痫、四肢麻木、拘挛僵直和角弓反张等心脑血管和神经系统症状和疾病有确切的预防作用和疗效［1-5］.同时_，服用藏药RNPS也具有滋补健身和抗衰老等功效.一些初步的实验研究发现:RNPS可明显降低大鼠“血瘀”低切变率下的全血黏度和全血还原黏度，并有利于血液循环的改善，具有一定的活血化瘀作用［6］.藏药RNPS对动物脑缺血具有保护作用，藏药RNPS灌胃给药对小鼠自主活动具有明显的抑制作用，对戊巴比妥钠阀下睡眠剂量具有明显的协同作用，并对乙醚引起的小鼠睡眠具有显著的协同作用，提示该药具有明显的中枢镇静作用［7］，同时该药的抗惊厥作用与脑内γ—氨基丁酸水平有关［8，9］.RNPS对乙醇所致小鼠学习记忆再现缺失和对樟柳碱所致小鼠记忆获得保障均具有良好的改善作用［10，11］.

生物光子是生物超弱发光(Ultraweak bioluminescence)的简称，普遍存在于细菌、微生物、植物、动物和人等各种生物体［12，13］.目前的研究表明，生物光子的活动和变化与机体的生理、病理状态有关.Inaba小组的研究发现，在癌症、糖尿病和黄疸等疾病患者的血液中生物光子辐射强度远高于健康人［14，15］.而生物光子特性改变与生理、病理状态密切相关.生物体内的氧化代谢、脱氧化作用、机械、热、化学应激、生物节律、情绪改变以及肿瘤发生等都有着内在的联系［16-20］.在人体上的研究表明，生物光子活动与意识、冥想、光幻视、睡眠和针灸经络有关［21-26］.

鉴于藏药RNPS复杂的药物成分和广泛的生理和药理作用，而生物光子的活动与机体生物活动有重要的联系，因此，我们假设藏药RNPS可能通过影响和调节机体生物光子的活动参与了其药理机制.本研究将使用中南民族大学武汉神经科学和神经工程研究所最新构建的生物光子检测(成像)系统来研究藏药七十味珍珠丸对小鼠脑、肝和肾脏组织细胞生物光子活动的影响，探讨其可能的药理机制.

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验动物购自湖北省疾病预防控制中心.健康成年雌性昆明小鼠，体重30～50 g，饲养于12 h光照/12 h黑暗的环境中，自由摄食和饮水，温度18～25℃，湿度40% ～50%，饲料为普通动物饲料，在中南民族大学动物室内适应一周后进行实验.

1.2 主要试剂

改良的人工脑脊液(M-ACSF)(252 mM蔗糖，26 mM NaHCO3，1.8 mM KH2PO4，10 mM D-葡萄糖;pH 7.6;渗 透 压 312 mOsmL－1);0.9% NaCl(pH 7.4);七十味珍珠丸(国字准字 Z54020062，西藏自治区藏药厂).

1.3 主要仪器

体视显微镜(型号:AZ100，尼康株式会产，含Plan Apo0.5×、1×、5×镜头)、EM-CCD 及其控制器(型号:C9100-13，日本滨松光子学株式会社;EM增益的调节范围为4～1200;当EM增益为1200时，暗电流为0.01e/p/s;在可见光范围内，其量子效率可以达到90%以上)、低温冷却液循环泵(型号:DLSB-5L/20，巩义市子华仪器有限责任公司)、蠕动泵(型号:BT100-1J，含DG-4泵头，保定兰格恒流泵有限公司)、预加热器(型号:SH-27B型，美国Warner公司)、双控恒温灌流控制器(型号:TC-344B型，武汉瑞普宁科技有限公司)、高亮LED灯(额定电压3V;直流供电;白，波长范围为410～600 nm，发光强度为10000～12000 mcd)、暗箱(外层钢板内层铅板，90.5 cm ×75.5 cm ×110.5 cm，上海艾道艾机械设备有限公司)、图像获取和分析软件.

1.4 生物光子检测系统的构建

生物光子检测系统主要由3部分组成，即检测子系统、状态维持子系统和刺激子系统，如图1所示.

检测子系统:该部分直接用于采集分析数据，主要包括体视显微镜(用于观察样品)、EM-CCD及其控制器(用于拍摄样品图像和采集生物光子信息)、计算机(内装有与EM-CCD配套的SimplePCI软件，可对EM-CCD进行设置和控制，并可对EM-CCD所采集得到的资料进行提取和分析)、低温冷却液循环泵(在EM-CCD水冷模式下，对EM-CCD进行制冷辅助).

状态维持子系统:该部分主要是为了保持检测过程中组织(或细胞)的活性，包括灌流槽(用于放置样品，并可通过置换其内的灌流液，维持组织的活性)、储液瓶(500 mL;用于储存 M-ACSF等灌流液)、气瓶(用于储存混合气体，保持灌流液体pH值和氧气浓度稳定，维持细胞活性)、蠕动泵(用于为灌流液进出灌流槽提供动力)、预加热器(对进入灌流槽的液体进行预加热，使进入灌流槽的液体维持一定的温度)、双控恒温灌流控制器(用来调节和控制预加热器和灌流槽的加热温度，并可实时监测液体温度，使组织在实验过程中保持恒温)、暗箱(用于隔绝外界光线和宇宙射线).

刺激子系统:该部分主要在实验过程中，对组织进行光、化学等刺激，包括光刺激器(以LED灯为基础制作，通过更换不同波长的LED或加载窄带滤光片对组织进行光照刺激，也可以用激光作为刺激光源)和光控制器(用来调节光线强度、光照时间等).

1.5 实验方法

1.5.1 实验分组

健康昆明雌性小鼠随机分成两组:实验组(RNSP组，n=12)和对照组(NaCl组，n=6).然后将实验组再随机分为低剂量0.5 g/kg和高剂量2.0 g/kg两个亚组(各亚组n=6).

图1 生物光子检测(成像)系统Fig.1 Biophoton detection(imaging)system

1.5.2 模型制备

RNSP处理:灌胃给药(ig)，对照组给等量生理盐水.实验组分别按RNSP 0.5 g/kg和2.0 g/kg给药，每天1次，共10 d.

灌胃方法:小鼠经口灌胃给药模型，先用右手将小鼠尾部抓住并提起，置于笼盖，用左手的拇指和食指抓住两耳和颈背部皮肤，然后将小鼠置于左手心中，拉直后肢，以小指按住尾巴.将灌胃针轻压至小鼠舌根，使口腔和食道成一条直线后，再将灌胃针沿上腭壁轻轻进入食道(一般将灌胃针插入2 cm即可).如果灌胃针插入的位置正确，小鼠会自己吞服药液，视为灌胃成功.如灌胃针插入的位置不正确，则小鼠会引起强烈挣扎，必须拨出重插，否则可能将药物灌入气管，会造成小鼠立即死亡.注射完后轻轻抽出灌胃针.

1.5.3 生物光子的检测

(1)取材和样品预处理.全部实验动物分别存活到预定时间点第11 d时(即ig给药第10 d后)，将动物称重后在10%水合氯醛深度麻醉下，断头处死，立刻将头浸泡于冰水浴的M-ACSF中(约10 s)，然后小心地将全脑取出.再用刀片冠状切面切取脑片(300μm)，将分离的脑片放入提前1 h通入95%O2和5%CO2混合气的冰水浴M-ACSF中暂存并持续充氧.同时分离肝和肾，并将肝组织切成厚片(300μm)，将分离的肝组织片和肾放入气体饱和的M-ACSF中充氧(图2).

(2)生物光子成像参数的选定.依据本实验室所构建的生物光子检测(成像)系统，将增益水平设置为1200后进行成像;每张图像曝光时间设置为6 s;对样品进行20 min的实时生物光子成像记录;白光LED光照时间为1 min.

图2 不同组织的图片Fig.2 Pictures of different tissues

(3)生物光子成像实验步骤.将组织样本放置灌流槽中(以下所有实验均在室温25℃左右条件下进行)，用少量M-ACSF湿润样本，先拍摄定位图像，关闭暗箱，避光约40 min，以排除环境光所引起的诱发光的干扰(其在15 min内基本衰减为本底的自发光);继续对样品进行20 min的实时生物光子成像;白光LED对样品施加1 min光照射后实时成像20 min.

(4)图像处理和数据提取.用EM-CCD配备的图像处理分析软件(SimplePCI 6.0)对图像和数据进行处理.

(5)统计学分析.所有数据结果使用SPSS13.0分析，采用双尾Student-t检验，各组之间差异用配对t检验分析，所有数据均以¯x±std表示，显著性标记如下:*P＜0.05(显著性差异)，＊＊P＜0.01(非常显著性差异).

2 结果

2.1 RNSP处理后脑片、肝和肾组织样本生物光子辐射和光诱导后生物光子辐射的改变

在避光暗适应40 min后成像20 min(0～1200 s，见图3 A，D 和 G，或者见图3 B，E 和 H)，实验组和对照组样品均具有稳定的生物光子辐射的本底值(基值)，灰度值均在2208左右，且不同样品(脑、肝和肾)没有明显差异.在白光照射1 min后，脑、肝和肾组织样本都表现明显的增强生物光子辐射和类似的衰减趋势(1200 ～2400 s，见图3 A，D和G)，但脑组织衰减曲线在实验组和对照组有明显不同，实验组比对照组衰减要慢(图3 C)，而肝和肾组织表现不明显(图3 F，I).

实验组和对照组样品(脑、肝和肾)均具有稳定的生物光子辐射的本底值(基值，0～1200 s，见图3 A，D和G，或者见图3 B，E和H)，且不同样品(脑、肝和肾)没有明显差异.同时，1 min光刺激后(1200 s时间点)表现明显的诱发生物光子辐射，而且脑组织衰减曲线在实验组和对照组有明显不同(图3 C)，但肝和肾组织表现不明显(图3 F，I).图3B，E和H分别是A，D和G在0～1200 s区间成像的放大图.

图3 不同组织的生物光子辐射和衰减图Fig.3 Diagram of the biophoton emission and decay in different tissues

2.2 比较白光照射对诱发生物光子辐射和衰减过程的影响

我们比较了在白光照射1 min后，实验组与对照组的不同组织(脑、肝和肾)诱发生物光子辐射的最大值的变化情况.总的来看，不管是实验组还是对照组诱发生物光子辐射的最大值灰度值改变为:脑＞肾＞肝.尽管统计学检验没有发现差异，但高、低剂量RNSP处理后脑组织诱发生物光子辐射的最大值灰度值比对照组高(图4 A).此外，比较实验组与对照组的不同组织(脑、肝和肾)诱发生物光子辐射衰减到50%时灰度值(图4 B)和衰减到50%时所需要的时间(图4 C).

不同组织(脑、肝和肾)实验组与对照组最大值无明显差别，而组织间实验组与对照组最大值灰度值差别明显，脑＞肾＞肝，特别是脑片与肝脏差异极其显著(图4 A，B).同时，比较实验组与对照组的不同组织(脑、肝和肾)诱发生物光子辐射衰减到50%时所需要的时间(图4 C).＊＊表示统计学差异极其显著(P＜0.01).

图4 白光照射对不同组织的诱发生物光子辐射的影响Fig.4 Effect ofwhite light illumination on the induced photon emission in different tissues

3 讨论

长期的临床应用发现藏药七十味珍珠丸具有控制高血压、镇静和抗惊厥作用，对心脑血管和神经系统等疾病有确定和较好的疗效，但其确切的药理作用机制仍不明确.藏药七十味珍珠丸的藏文译音为然那桑培(Rannasangpei，简称RNSP)，RNSP是传统藏药大组方药品的典型代表之一，它是由70余种名贵藏药原料组成.RNSP一个明显的特点是该药的组成成分含有一定量的金、银、铜和铁等10余种重金属矿物质，尽管有些传统的中药方剂也应用了一些含有重金属成分药物，但RNSP所包含的这些成分显得尤为特别.虽然在藏药七十味珍珠丸的制药过程中经过一系列独特的炮制技术后可能降低了药品的毒性和提高了临床用药的安全性，但这些重金属成分的存在与RNSP药效可能有一定的关系，而且，传统的藏药七十味珍珠丸的炮制需要一定的时间并带有神秘的宗教色彩.

生物光子是普遍存在于自然生物界的一种极其微弱的光子辐射现象，小至细菌微生物，大到植物、动物甚至人，都有自发的生物光子发射.对动物和人的研究发现生物光子的活动与生物体生理状态和病理过程有着密切的联系，自然环境的光作用于生物体的细胞和分子可以引起生物体生物光子的活动，进一步对生物体的功能活动(如代谢、信息传递等)产生影响.研究发现血液细胞可以起到传递生物光子能量和信息的作用，即一个组织的生物光子活动可以通过血液将其生物光子能量和信息传到其它的组织和细胞［20］.我们最近的研究发现生物光子可能起到神经信号传递的作用，并可能对于一些特殊视觉现象如光幻视、视觉后像以及视网膜离散暗噪音产生的机制提供新的解释［27-29］.此外，生物体生物光子的异常改变可能与老年、疾病的过程如肿瘤的发生等也有一定的联系［30-32］.因为生物光子的活动不完全停留在细胞和分子水平，已经涉及到了分子的原子水平，甚至需要用量子的理论才能给予解释.是否传统医药的药理机制已经涉及到了原子水平和量子的理论值得我们探讨.

在本研究中，我们假设RNPS可能通过影响机体的生物光子的活动来发挥药理作用.通过建立实验小鼠模型并应用先进的生物光子成像系统进行测定，结果发现脑片、肝和肾均具有自发生物光子辐射现象和明显增强的光诱发生物光子辐射.RNPS处理虽然没有改变脑、肝和肾组织样本的自发生物光子辐射，但增强了脑、肝和肾组织样本的光诱发生物光子辐射强度.特别是对脑组织光诱发生物光子辐射衰减过程产生影响.我们的结果提示RNPS处理可能影响了动物组织和器官生物光子的活动，发挥其药理作用，但是确切的机制有待进一步研究，我们推测可能的作用机制是:(1)藏药七十味珍珠丸对胃肠道组织的直接作用，影响其生物光子的活动，活动信息可能通过血液的能量(生物光子光能)转换，进一步影响或调节其它组织器官的功能.(2)藏药七十味珍珠丸的药效成分通过胃肠道组织的直接吸收，通过血液循环到达组织器官，直接影响或调节组织器官和细胞的功能.

上面提到藏药七十味珍珠丸一个明显的特点是该药的组成成分含有一定量的金、银、铜和铁等10余种重金属矿物质，研究发现一些重金属矿物质有高效率转换光能(吸收和辐射)的特征，这是否与藏药七十味珍珠丸增强生物光子辐射强度有直接的关系有待进一步研究.

4 结语

我们发现藏药七十味珍珠丸处理昆明小鼠能影响脑、肝和肾组织光诱发生物光子辐射的强度和衰减过程，可能是藏药七十味珍珠丸发挥其广泛临床治疗作用的原因之一，其作用机制可能是通过影响或调节组织器官和细胞生物光子活动以及生物信号传递，确切的机制有待进一步研究.

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