李良满，李静波，朱悦

（中国医科大学附属第一医院 1.骨科；2.感染科，沈阳 110001）

草麻黄补体抑制成分在大鼠急性脊髓损伤中的作用

李良满1，李静波2，朱悦1

（中国医科大学附属第一医院 1.骨科；2.感染科，沈阳 110001）

目的探讨草麻黄补体抑制成分在大鼠急性脊髓损伤中的作用。方法 应用多步沉淀和薄层层析方法进行草麻黄补体抑制成分的提纯并进行活性鉴定；参照改良的Allen’s重物打击法制备大鼠脊髓损伤模型；应用CH50法测定血清总补体溶血活性；应用实时PCR技术检测细胞间黏附分子1（ICAM-1）mRNA的表达；采用运动诱发电检测评定脊髓损伤后的神经功能。结果 在伤后12h、1d、3d、7d、14d各个时间点，实验组CH50比值和ICAM-1mRNA表达均低于对照组（P<0.01）。伤后7d和14d，实验组脊髓运动诱发电位潜伏期和波幅显著优于对照组（P<0.01）。结论草麻黄补体抑制成分能够显著减轻脊髓损伤后的免疫炎性反应，在继发性脊髓损伤中起到重要的保护作用。

草麻黄；脊髓损伤；炎症；诱发电位

doiCNKI：21-1227/R.20110523.1816.029

脊髓损伤继发性损伤机制复杂，目前临床上还缺乏有效的治疗药物，免疫炎性反应是重要损伤机制之一，脊髓损伤后存在补体系统的激活，并且补体系统激活后产生的活性片断及最终产物均可引起和加重损伤组织的免疫炎性反应，通过抑制补体系统激活而减轻免疫炎性反应有望成为脊髓损伤新的治疗策略［1，2］。本研究探讨中药草麻黄（Ephedra sinica，ES）提纯的补体抑制成分对大鼠急性脊髓损伤后免疫炎性反应及神经功能的影响，为急性脊髓损伤的抗补体治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 草麻黄补体抑制剂的提纯

应用多步沉淀及薄层层析方法进行草麻黄补体抑制成分的提纯并进行活性鉴定。1kg草麻黄加入pH4.0的蒸馏水10L，煮沸1h，过滤除渣，加入1mol/L NaOH调整pH值至9.0，室温搅拌孵育1h，离心，洗涤沉淀3次，室温烘干得到棕褐色粗品共18.5g。取3g粗品溶于pH4.0的蒸馏水50mL中，煮沸1h，离心弃上清，溶于pH 9.0的蒸馏水中，调整pH值至4.0，进行薄层层析，分离提取抗补体成分。

1.2 实验动物分组及脊髓损伤模型制备

健康SD大鼠50只，SPF级，雌雄不拘，体质量250～300g。采用改良的 Allen’s重物打击法［3］方法制备大鼠脊髓急性损伤模型，损伤部位为T10节段。随机分为2组，每组25只。实验组：分脊髓损伤后12h、1d、3d、7d、14d 五个时间点，每个时间点 5只，伤后1h给予提纯的补体抑制成分（15mg/kg）溶于5mL生理盐水，强制灌胃，每日1次。对照组：时间点及动物数量同前，以同样方法给予等量生理盐水灌胃。

1.3 血清总补体溶血活性测定

应用CH50法进行血清总补体溶血活性测定。在大鼠脊髓损伤前1h、伤后12h及伤后1～14d，尾静脉抽血0.3mL，离心，取上清，-20℃保存备用。制备2%绵羊红细胞悬液，溶血素效价测定，制备50%溶血标准管，然后将各浓度梯度反应体系置于微量板孔中，反应完毕后在541nm波长处测吸光度，计算待测血清的CH50值并与损伤前血清样品的基础值比较，计算百分比值。

1.4 细胞间黏附分子1（intercellular adhesive molecule-1，ICAM-1）mRNA 的检测

应用实时PCR方法检测损伤组织中ICAM-1mRNA的表达。2组动物于伤后每个时间点各取5只再次麻醉，以伤处T10为中心取约100mg脊髓损伤组织，应用Trizol法提取总RNA，并进行RNA纯度及浓度检测，逆转录cDNA合成，应用Premier 5.0设计引物序列。以管家基因GAPDH作为内参。操作严格按照说明书进行。ICAM-1正义引物：5′-TGCC TACCCTCCCACAACAG-3′，反义引物 5′-ATACTATG TGGACGAGCATGT-3′，320bp；GAPDH 正义引物：5′-AGTTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，反义引物5′-AGACTCCACGACATACTCAGC-3′，283bp。应用LightCyclerⅡPCR检测仪进行检测，绘制融解曲线，PCR专用分析软件根据标准品的Ct值制作标准曲线，计算每个样本原始拷贝数，然后计算样品基因校正后的相对含量。

1.5 运动诱发电位检测

参照Lee［4］的方法检测脊髓运动诱发电位（motor evoked potential，MEP），各组大鼠分别于脊髓损伤前 0.5h 及伤后 12h、1d、3d、7d、14d 行 MEP 检测，检测在铜网屏蔽下进行。大鼠麻醉后，将刺激电极阴极刺于T5～6间隙、阳极刺于T7～8间隙，刺激类型为方波脉冲电流，波宽0.1ms，强度100～150mV，滤波带通过2Hz～10kHz。电位记录仪采集信号并贮存，专用软件分析和测量其潜伏期（latency，LT）和波幅（amplitude，AM）。将损伤前MEP的测量值作为基础值，以百分比表示损伤前后的电位变化。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 血清CH50测定结果

实验组和对照组伤后早期血清CH50比值迅速下降，约在伤后1d达到最低值，分别29.05%±2.08%和24.08%±2.31%；伤后3～7d快速上升，以后缓慢回升，伤后14d对照组CH50接近伤前水平（98.21%±1.12%），而实验组仅达到伤前的75%左右。伤后12h及伤后1～14d各个时间点实验组的CH50比值均低于对照组，有统计学差异（P<0.05）。

2.2 ICAM-1mRNA检测结果

脊髓损伤后，实验组及对照组ICAM-1mRNA相对含量开始升高，约在伤后3d达到高峰，之后开始逐渐下降，存在一个动态变化过程。伤后各个时间点实验组ICAM-1mRNA相对含量均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。见图1。

2.3 MEP检测结果

实验组及对照组在伤后早期AM值快速下降，仅达伤前正常值的15%左右，而且LT值明显延长，较伤前正常值延长约30%。随着时间的延长，AM值开始快速回升，LT值亦逐渐缩短。伤后14d，对照组AM值回升到伤前正常值的73%，实验组AM值回升到了80%，2组的LT值亦逐渐缩短。伤后12h～3d，2组的电生理检测指标无明显差别；伤后7d和14d，实验组电生理检测指标显著优于对照组（P<0.01）。见图 2。

3 讨论

脊髓损伤作为一种严重的创伤，可以激发机体引起损伤组织强烈的免疫炎性反应。从严格意义上来讲，脊髓损伤后免疫炎性反应是一把双刃剑。一方面该过程可以清除坏死组织，促进组织细胞增生和创面修复。另一方面，严重的创伤时存在炎性反应的过度激活，这将导致脊髓组织进一步的损伤，妨碍脊髓组织的修复和神经元的再生，导致神经元、神经胶质细胞等继发性的坏死和凋亡，从而阻碍损伤后神经功能的恢复［5］。

脊髓损伤后免疫炎性细胞的聚集受多种蛋白质的调控，ICAM-1又名CD54，是淋巴细胞功能相关抗原l的细胞表面配基。ICAM-1可促进中性粒细胞对组织的浸润而增强免疫应答，促进中性粒细胞和内皮细胞相互作用，这些因素共同导致中性粒细胞浸润和活化。本研究应用实时PCR技术检测了脊髓损伤后脊髓组织ICAM-1mRNA的表达，结果表明，实验组在各个时间点ICAM-1mRNA相对含量均低于对照组，提示该补体抑制剂对脊髓损伤组织中ICAM-1mRNA表达具有的显著抑制作用，证明了其对免疫炎性反应的抑制作用。

近几年来，通过抑制补体激活机制抑制脊髓损伤后的免疫炎性反应已经成为脊髓损伤实验性治疗的一个重要策略和热点方向。Reynolds等［6］发现痘病毒补体调控蛋白能够显著抑制大鼠脊髓损伤后的补体表达，减轻脊髓损伤。Qiao等［7］的研究表明，补体经典途径与旁路途径在脊髓损伤中起到重要作用，抑制补体激活可减轻损伤组织炎性反应，保护脊髓功能。Tei等［8］研究发现，补体C1酯酶抑制剂能够显著抑制补体系统激活，保护神经功能。作者在前期的研究中亦发现，重组可溶性补体受体I型可显著抑制大鼠脊髓损伤后的补体激活，抑制免疫炎性反应，对神经功能发挥显著的保护作用［9］。

本研究采用MEP评价脊髓损伤损伤后的运动功能，使研究结果更加客观可靠。结果表明，实验组在伤后7d和14d电生理检测指标显著优于对照组，提示该补体抑制成分通过抑制脊髓损伤后的免疫炎性反应对神经功能发挥显著的保护作用。该研究为急性脊髓损伤的抗补体治疗提供了理论依据。

［1］Batchelor PE，Tan S，Wills TE，et al.Comparison of inflammation in the brain and spinal cord following mechanical injury［J］.J Neurotrauma，2008，25（10）：1217-1225.

［2］Guo Q，Li S，Liang Y，et al.Effects of C3deficiency on inflammation and regeneration following spinal cord injury in mice ［J］.Neurosci Lett，2010，485（1）：32-36.

［3］Nessler JA，Deleon rd，Sharp K，et a1.Robotic gait analysis of bipedal treadmill stepping by spinal contused rats characterization of intrinsic recovery and comparison with BBB［J］.J Neurotrauma，2006，23（6）：882-896.

［4］Lee BH，Lee KH，Kim UJ，et al.Injury in the spinal cord may produce cell death in the brain［J］.Brain Res，2004，1020（1-2）：37-44.

［5］Chan CC.Inflammation：beneficial or detrimental after spinal cord injury?［J］.Recent Pat CNS Drug Discov，2008，3（1）：189-199.

［6］Reynolds DN，Smith SA，Zhang YP，et al.Vaccinia virus complement control protein reduces inflammation and improves spinal cord integrity following spinal cord injury ［J］.Ann NY Acad Sci，2004，1035（1）：165-178.

［7］Qiao F，Atkinson C，Kindy MS，et al.The alternative and terminal pathways of complement mediate post-traumatic spinal cord inflammation and injury［J］.Am J Pathol，2010，177（6）：3061-3070.

［8］Tei R，Kaido T，Nakase H，et al.Protective effect of C1esterase inhibitor on acute traumatic spinal cord injury in the rat［J］.Neurol Res，2008，30（7）：712-717.

［9］Li LM，Li JB，Zhu Y，et al.Soluble complement receptor type 1inhibits complement system activation and improves motor function in acute spinal cord injury［J］.Spinal Cord，2010，48（2）：105-111.

（编辑陈 姜，英文编辑刘宝林）

Effect of Inhibiting Component of Complement in Ephedra Sinica on Acute Spinal Cord Injury in Rats

LI Liang-man1，LI Jing-bo2，ZHU Yue1
（1.Department of Orthopedics；2.Department of Infectious Disease，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the effect of complement inhibiting component of Ephedra sinica on acute spinal cord injury in rats.MethodsThe inhibiting component of complement in Ephedra sinica was isolated and purified by multiple precipitative steps and thin layer chromatography，the activity was evaluated.Induction of spinal cord injury was performed following a modified Allen’s weight-drop method.CH50method was used for Measurement of complement hemolytic activity.ICAM-1mRNA level was evaluated by real time PCR technique.ResultsCH50and ICAM-1mRNA levels were significantly reduced in the Ephedra sinica group compared with the Control group at 12h，1，3，7，14d after spinal cord injury.On the 7th and 14th day，the levels of latency and amplitude in Ephedra sinica group were significantly better than those of Control group （P<0.01）.ConclusionThe inhibiting component of complement in Ephedra sinica significantly reduced immunological inflammation after spinal cord injury，and played an important protective function in secondary spinal cord injury.

Ephedra sinica；Spinal cord injury；Inflammation；Evoked potential

R338

A

0258-4646（2011）05-0405-03

http：//www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20110523.1816.029.html

辽宁省科学技术计划项目（2010225034）

李良满（1971-），男，副教授，博士.

朱悦，E-mail：yuezhudr@163.com

2011-01-17

网络出版时间：2011-05-1815：25