杨 青，全雄志，廉 虹，张 旭，马春梅，张连峰

（中国医学科学院，北京协和医学院，医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021）

白介素最早发现在白细胞中表达作为细胞间信号传递，可以由多种细胞产生，不但参与调节免疫应答还广泛参与调节机体的生理病理过程。迄今发现并命名的白介素家族的成员共有37种，它们存在于多种组织中，具有广泛的生物学活性。白介素34（Interleukin34，IL34）是2008年Haishan Lin等发现的细胞因子［1］，它可以与在单核细胞表面的表达的集落刺激因子受体（colony stimulating factor 1 receptor，CSF1R）结合，促进骨髓中巨噬细胞集落的形成。IL34在脾中有高表达，提示该基因对免疫系统有一定的作用，但其作用机制尚不清楚。本研究通过转基因技术，将人IL34基因转入C57BL/6J小鼠，建立了人IL34转基因小鼠，为进一步研究 IL34的作用建立了模型。

1 材料和方法

1.1 IL34表达载体的构建及转基因

从Origene公司购买人IL34质粒，以EcoRⅠ和NotⅠ酶切质粒，胶回收IL34基因片段，然后将该片段插入到从Origene公司购买的pCMV-MIR载体中CMV启动子的下游，构建 IL34转基因载体。提取并酶切鉴定质粒正确后，用 Tth111I将其线性化，SephedexG50柱纯化 DNA片段，获得 CMV启动的IL34基因的转基因片段，注射前将转基因片段的浓度调整至5 ng/uL，用显微注射法［2］将线性化的转基因表达载体注射到 C57BL/6J小鼠的受精卵中（小鼠购自康蓝公司［SCXK（京）2004001］），用ICR小鼠作假孕受体（本实验室饲养），制备转基因小鼠（TE2000-U显微注射仪）。实验中涉及动物的操作程序已经得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为GC-08-2036。

1.2 PCR鉴定IL34转基因动物的基因型

转基因小鼠在出生9～14 d用剪趾法标记，收集剪下的组织，用碱裂解法提取基因组DNA［3］，用PCR检测IL34转基因小鼠，PCR引物为（上海英潍捷基贸易有限公司，中国），PCR试剂购自宝生物工程有限公司，中国。PCR 上游引物为 5＇GTCAATGGGTGGAGTATTTACG，下游引物为 5＇GCTTATATAGACCTCCCACCGT。反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环。IL34片段为386 bp。

1.3 W estern b lotting鉴定IL34基因在蛋白水平的表达

选用1月龄的转基因阳性和同窝阴性小鼠，颈椎脱臼法牺牲小鼠，迅速取出脾组织置匀浆器中，加入1 m L的RIPA蛋白裂解液，将组织匀浆破碎后静置30 m in，然后4℃，1300 rpm离心30 min，取上清液即为脾组织总蛋白。BCA法测定浓度，取等量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，随后将蛋白转移至PVDF膜，5％脱脂奶粉室温封闭30 m in。用 TBST以1：1000浓度稀释棉羊抗人IL34单抗，将一抗与膜封入杂交袋中，4℃过夜。弃去一抗，TBST洗膜3次，每次10 min。用TBST以1：20000浓度稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗绵羊 IgG，同时加入 β-actin抗体于杂交盒中，放入膜，室温摇床孵育1 h。弃去二抗TBST洗膜3次，每次10 min。将膜至于化学发光剂中，曝光、显影及定影。

1.4 IL34转基因小鼠的病理学检测

选用2月龄IL34转基因小鼠和同窝阴性小鼠，颈椎脱臼法牺牲小鼠，取心、肝、脾、肺、肾、脑及小肠等重要器官然后用10％福尔马林溶液中固定48 h，进行取材、脱水、包埋、切片、HE染色及光镜下观察（Nikon显微镜，日本）。

2 结果

2.1 IL34表达载体的构建和转基因小鼠基因表型的鉴定

从Origenen购买的人IL34质粒（GenBank No.NM_152456）。将该基因酶切回收后插入从Origene公司购买的pCMV-MIR载体中CMV启动子的下游，构建IL34转基因表达载体（图1）。

图1 IL34转基因表达载体Fig.1 IL34 transgenic construct

用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，转入到假孕受体ICR小鼠中，小鼠出生后9 d提取基因组DNA，用PCR扩增IL34目的基因386 bp的片段来鉴定IL34转基因小鼠（图2），共得到5只首建鼠，均可传代，留下两个表型明显的保种。

2.2 W estern b lotting检测IL34基因在蛋白水平的表达

分别提取出生1月龄的转基因小鼠和同窝阴性小鼠的脾组织总蛋白，用人 IL34单克隆抗体进行Western blotting分析，结果显示有 2个 Founder的F1代有人 IL34高表达，分别为13和24首建鼠。IL34蛋白分子量大小为27×103。

图2 PCR鉴定IL34转基因动物的凝胶电泳分析1、空白对照；2、阴性对照；3、阳性对照； 4、DNA分子量标记DL2000；5、6、8、10、12 F1代转基因小鼠；7、9、11 F1代阴性小鼠Fig.2 Genotyping of the transgenic mice with PCR Lane 1 was blank control；Lane 2 was negative control； Lane 3 was positive control；Lane 4 was DNA molecular weightmarker（DL2000）；Lane 5，6，8，10 and 12 werethe positive transgenic mice；Lane 7，9 and 11 were negative controls

图3 人IL34蛋白在IL34转基因小鼠脾组织中的表达1号野生型小鼠；2、3号阳性小鼠；用β-actin作为内对照Fig.3 The column Fig.re of different lesions in different age groups Expression of human IL34 in the transgenic spleen The Lane 1 was the wild type spleed.The lane 2 and 3 were samples from the transgenic spleed of founder 13 and founder 24.The same NC membrane was normalized withβ-actin

2.3 病理学检测

将2月龄IL34转基因小鼠和同窝阴性小鼠的重要器官进行病理解剖，HE染色高倍镜下可观察到IL34转基因小鼠的脾脏中白髓比较活跃，白髓范围比对照鼠大（彩插4图 4），其他组织没有明显变化。

3 讨论

白介素最早发现其主要作用是激活和调节免疫细胞，参与免疫调节过程。但随着研究的不断深入，发现白介素还广泛地参与调节机体的生理病理过程。白介素的重要作用越来越受到研究者们的关注，迄今为止人们发现并命名了37种白介素细胞因子［4］。IL34是2008年Haishan Lin等［1］发现的又一白介素家族成员，它可以与CD14+单核细胞特异性结合，促进单核细胞的增殖和分化。通过功能筛选还证明了IL34是 CSF1R的配体，和CSF1R另一个配体巨噬细胞集落刺激因子（macrophage-colony stimulating factor，M-CSF1）的功能相似，IL34也能刺激骨髓中单核母细胞向巨噬细胞分化［5］。M-CSF在炎症反应的细胞因子调节网络中起着非常重要的作用，在各种炎性和自身免疫性疾病如风湿性关节炎［6］、肾炎［7，8］、肺炎［9］、动脉粥样硬化［10］、骨巨细胞瘤［11］等重大疾病中都起到了重要的作用。IL34是近两年才发现的细胞因子，生物活性与 MCSF相似［12］，但促巨噬细胞分化的能力低于 MCSF，且其功能以及对各种疾病的调节作用还未明确。最近两年对 IL34的研究都是集中在体外研究或者使用重组 IL34进行体内研究［13］，而且其使用量远远超过了机体内的生理浓度，维持时间短等特点，因此我们建立了 IL34转基因小鼠，为研究内源性IL34对机体的作用提供了很好的模型。

在本研究中，首建鼠F13和F24的后代小鼠，PCR结果显示了外源基因能稳定地按孟德尔规则传递到下代。Western blot结果显示IL34基因的表达量在F13和F24转基因小鼠的脾组织中与野生型小鼠的相比显著增高，表明成功建立了IL34转基因小鼠。通过病理学检测发现，IL34转基因小鼠的脾脏的白髓区域比较活跃，白髓范围比野生型小鼠的大。说明免疫细胞增生活跃，提示IL34对免疫系统有一定的作用，但其机制尚未清楚。因此，IL34小鼠的建立，为进一步对内源性IL34的生物学功能及对机体免疫系统的调节作用机制提供很好的实验依据。

［1］Lin H，Lee E，Hestir K，et al.Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome［J］.Science 2008，320：807-811.

［2］Gordan J， Ruddle F. Integration and stable germ line transmission of genes injected intomouse pronuclei［J］.Science，1981，214（4526）：1244-1246.

［3］Chishti M，Yang D，Janus C，et al.Early-onset amyloid deposition and cognitive deficits in transgenic mice expressing a double mutant form of amyloid presursor protein695［J］.J BiolChem，2001，276（24）：21562-21570.

［4］Nold M，Nold-Petry C，Zepp J，et al.IL-37 is a fundamental inhibitor of innate immunity［J］.Nat Immunol.2010，11（11）： 1014-22.

［5］Marc Baud H，Romain R，C＇eline C et al.Interleukin-34 is expressed by giant cell tumours of bone and plays a key role in RANKL-induced osteoclastogenesis［J］.JPathol 2010，221：77 -86

［6］Bischof R，Zafiropoulos D，Hamilton J，et al.Exacerbation of acute inflammatory arthritis by the colony-stimulating factors CSF-1 and granulocyte macrophage （GM）-CSF： evidence of macrophage infiltration and local proliferation［J］.Clin.Exp.Immunol.2000，119：361-367.

［7］Lenda D，Kikawada E，Stanley E，et al.Reduced macrophage recruitment，proliferation，and activation in colony-stimulating factor-1-deficient mice results in decreased tubular apoptosis during renal inflammation［J］.J Immunol.2003，170：3254-3262.

［8］Le Meur，Y.et al.Macrophage accumulation at a site of renal inflammation is dependent on the M-CSF/c-Fms pathway［J］.J.Leukocyte Biol.2002，72：530-537.

［9］Baran C.et al.Important roles formacrophage colony-stimulating factor，CC chemokine ligand 2，and mononuclear phagocytes in the pathogenesis of pulmonary fibrosis［J］.Am.J.Respir.Crit.Care Med.2007，176：78-89.

［10］Isabelle B，Seraya M，HervéD，et al.Antagonistic regulation of macrophage phenotype by M-CSF and GM-CSF：Implication in atherosclerosis［J］.Atherosclerosis.2011，214（2）：316-24.

［11］Niida S，Kaku M，Amano H，et al.Vascular endothelial growth factor can substitute for macrophage colony-stimulating factor in the support of osteoclastic bone resorption［J］.JExp Med 1999； 190：293-298.

［12］Suwen W，Sayan N，Violeta C，et al.Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation ofmyeloid cells［J］.JLeukoc Biol.2010，88（3）：495-505.

［13］Eda H， Zhang J， Keith RH， et al. Macrophage-colony stimulating factor and interleukin-34 induce chemokines in human whole blood［J］.Cytokine.2010，52（3）：215-20.