王 洁，许建英

（山西医科大学第一临床医学院呼吸科，太原 030001）

研究表明吸烟可导致肺部慢性炎症，其发生发 展过程可能与免疫系统对有毒物质的调节失衡有关［1］。目前认为香烟烟雾中的抗原物质可以影响机体的免疫状态，同时也是引起呼吸道及肺组织病理学改变的重要因素之一［2］。抗原提呈细胞（antigen presenting cells，APC）作为机体免疫反应的首要环节，可将外源性抗原消化降解成含抗原决定簇的肽链，与细胞膜表面的主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）结合，形成抗原肽-MHC。此时APC表面的B7-1、B7-2分子与表达于T细胞表面的CD28、CTLA-4分子互相作用，引起特异性免疫反应。本实验通过研究吸烟对大鼠肺组织 B7-1/ B7-2及其相关配体表达的影响，探讨专职APC在吸烟所致肺部慢性炎症发生发展过程中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

W istar大鼠（山西医科大学实验动物繁育中心提供［SCXK（晋）2009-0001］）；实验用香烟为芙蓉牌过滤嘴香烟（湖南中烟工业公司，焦油含量12 mg/支，烟碱量0.1 mg/支）；兔抗B7-1抗体，兔抗B7-2抗体，兔抗CD28抗体，兔抗CTLA-4抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；SABC（兔IgG）试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；DAB显色剂（北京中杉金桥生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型制备：将 30只健康雄性W istar大鼠，体重200±20 g。随机分为不吸烟组、吸烟6周组和吸烟12周组，每组10只。吸烟组大鼠放入自制实验性大鼠被动吸烟装置［3］（自动助燃装置连接密闭玻璃箱）内，每次吸烟15支（约2 h），一日2次（上午、下午各1次），每周吸烟6 d，分别吸烟6周和12周。不吸烟大鼠正常饲养12周，与吸烟大鼠饲养条件和环境相同。

1.2.2 标本采集：乌拉坦麻醉后处死动物，开胸取肺组织。抽取4％中性甲醛3 m L经主支气管均匀的注入两肺内，并置入4％中性甲醛中固定48 h。石蜡包埋切片，用于HE染色及免疫组化染色。

1.2.3 B7/CD28/CTLA-4免疫组化染色：一抗稀释浓度为B7-1（1∶200）、B7-2（1∶200）、CD28（1∶300）、CTLA-4（1∶300），阴性对照以 PBS代替一抗。采用过氧化物酶标记的链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SABC）免疫组化检测试剂说明书进行免疫组化半定量染色。

1.2.4 图像分析及结果判断：用 BX-51型 Olympus显微镜及 MISA-2000数码显微图像分析系统对免疫组化染色切片进行图像分析。每张切片随机选取3个含有完整支气管环的气道，其内腔直径为400μm～600μm之间。高倍视野下（放大倍数40×10倍）观察气道周围间质中炎症细胞的分布情况。采图（规格15 cm×18 cm）并随机选取3个气道周围面积为3 cm×3 cm大小的肺间质作为测量区。结果判断：细胞膜周围出现点状、片状或半月形的棕黄色标记物为阳性单位。排除气道周围血管内或肺泡内免疫组化染色呈棕黄色的阳性单位。分别测量阳性单位的积分光密度、平均光密度、平均灰度。

1.3 统计学分析

所有数据以均数±标准差表示，采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，组间比较用 SNK-q检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。同时以横轴为吸烟时间，纵轴为平均光密度值（OD），绘制 B7/ CD28/CTLA-4的线性趋势图。

2 结果

2.1 大鼠肺组织病理学改变

HE染色显示：不吸烟组大鼠肺泡结构完整，各级支气管管腔内及肺间质中少量的炎细胞浸润。吸烟6周组可见支气管纤毛倒伏，出现脱落。小气道腔内出现粘液栓、管壁充血水肿，支气管腔内和肺间质中可见淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等炎症细胞浸润。吸烟12周组肺支气管周围平滑肌束增厚肥大或断裂萎缩，管腔纤毛柱状上皮细胞脱落或变性。支气道腔内及肺间质中可见炎性细胞，以巨噬细胞和淋巴细胞居多，部分气道出现粘液栓。肺泡间隔纤维样改变，出现肺泡融合形成肺大疱。

2.2 B7/CD28/CTLA-4免疫组化染色

2.2.1 免疫组化阳性结果描述：两组吸烟大鼠支气管、血管周围及肺间质中可见不同程度表达为阳性的炎症细胞，B7-1、B7-2的表达以巨噬细胞、淋巴细胞为主，CD28、CTLA-4的表达以淋巴细胞为主。不吸烟组大鼠表达为阳性的炎症细胞较少（见彩插3图1）。

2.2.2 半定量结果分析：吸烟6周组与吸烟12周组大鼠肺组织 B7-1、B7-2、CD28、CTLA-4表达量较不吸烟组均显著增高（P＜0.01），吸烟12周组较吸烟6周组各指标的表达量也均增高（P＜0.01），差异均有统计学意义（见表1）。

表1 B7-1/B7-2及其相关配体CD28/CTLA-4的表达量（OD值） Tab.1 The expression of B7-1/B7-2 and its associated ligands CD28/CTLA-4 in chronic pulmonary inflammation

2.2.3 B7/CD28/CTLA-4变化趋势：B7-1与 B7-2的表达量随吸烟时间的延长呈上升趋势且线形相近。CD28和CTLA-4的表达量随吸烟时间的延长也呈上升趋势，吸烟6周时CD28表达量上升趋势较CTLA-4缓慢；吸烟12周时CD28表达量上升趋势较CTLA-4快。（见图2）

图2 B7/CD28/CTLA-4的趋势线形图Fig.2 The changed Trend of B7/CD28/CTLA-4

3 讨论

每支香烟燃烧时能产生大约4700多种化学物质［4］，其中有相当一部分是有害的，如香烟烟雾中的抗原物质烟草糖蛋白，作为外源性抗原物质进入呼吸道内，在肺组织中形成或出现新的抗原表位。再由肺部专职APC（树突细胞、肺巨噬细胞、B淋巴细胞和肺部嗜酸性粒细胞）通过抗原肽-MHC和共刺激分子将抗原信息传递给T细胞，使T细胞活化增殖。其中B7/CD28/CTLA-4被认为是激活T细胞作用效果最强的共刺激分子。

有研究表明B7-1、B7-2分子共有25％的氨基酸同源序列，但不论T细胞活化阶段还是组织分布上这两种分子在 APC上的表达和分布均不同［5］。正常静息状态下APC几乎不表达 B7-1，巨噬细胞、B细胞及树突细胞则表达较少的 B7-2。在抗原刺激下，活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞B7-1和 B7-2表达水平都明显增高［6］。本实验结果表明不吸烟组气道间质组织中巨噬细胞与淋巴细胞细胞膜表面B7-1和B7-2表达呈弱阳性，吸烟6周组和吸烟12周组B7-1及B7-2表达水平较不吸烟组明显增高，但随吸烟时间延长两者的增高趋势相似但并不完全相同。由此推测，APC表面的B7分子与 T淋巴细胞表面的CD28/CTLA-4结合的氨基酸序列及结合速率均不同。

CD28/CTLA-4是一对具有正负调节功能的共刺激分子。CD28在调节T细胞活化增殖的过程中起着极其重要的作用，与B7结合后可促进T细胞抗原受体（T cell antigen receptor，TCR）介导细胞增殖，防止TCR诱导 T细胞进入无反应状态［5］。CD28能调节并维持适量的、有功能的T细胞存活以保证特异性免疫应答存在，同时也可通过细胞因子激活CTLA-4维持免疫过程的平衡和稳定。CTLA-4与B7结合的亲和系数是 CD28的20～150倍［7］，有利于炎症早期抗原刺激较少时，APC表面 B7分子与CTLA-4结合并抑制T细胞激活。本实验结果表明：吸烟6周组，CD28表达量上升缓慢，CTLA-4表达量与之相比上升趋势较快；吸烟12周组，CD28表达量上升趋势较快，CTLA-4上升趋势较平缓。B7表达量增高的同时CD28和CTLA-4表达量也有所增高。提示炎症初期CTLA-4表达增高，并可能与CD28竞争性结合B7分子从而抑制T细胞活化增殖，可下调或终止T细胞的反应。随着炎症反应的进展 CD28与B7结合占优势使T细胞逐渐被激活。尽管本实验大鼠B7/CD28/CTLA-4（吸烟12周内）在肺部慢性炎症发生发展中表达呈增高趋势，但有研究显示随着免疫耐受和炎症介质引起抗原提呈功能受限等问题出现，共刺激分子的表达不会无限制增高［8］。

B7/CD28/CTLA-4为APC激活T细胞的必要途径，进而动员炎症反应、进一步激活辅助B细胞、发挥细胞毒作用，从而产生大量的细胞因子。在肺组织中可刺激上皮细胞、破坏气道纤毛系统及上皮屏障、激发气道和肺组织慢性炎症。本实验中即可见吸烟组大鼠气道上皮倒伏、脱落、杯状细胞数增多，部分气道出现鳞状上皮化生。气道、血管周围及肺泡内有大量炎症细胞浸润。小气道肌层萎缩或肥大、肺泡结构破坏形成肺大疱并出现肺组织纤维化。由此可见，B7/CD28/CTLA-4作用机制可能参与了肺部慢性炎症及其所引起的病理学改变。

综上所述，吸烟可引起大鼠肺组织 B7/CD28/ CTLA-4表达水平的增高，促进或抑制T细胞的活化增殖以调节适应性免疫反应，提示APC可能在吸烟所致肺部慢性炎症发生发展中起重要的作用。这也为临床上阻断或延缓吸烟所致的肺部慢性炎症的进程提供了新的治疗思路，但其具体调节机制还有待进一步研究。

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