李年珍，张焕萍，柴景伟，张 彬

（1.山西医科大学，太原 030001；2.山西医科大学第一临床医学院呼吸内科，太原 030001）

气道平滑肌细胞（ASMCs）在哮喘气道慢性炎症、气道高反应性及气道重塑中均具有十分重要的作用。近年来研究表明，ASMCs不仅具有收缩和增殖功能，而且还有分泌功能［1］。ASMCs可分泌一些细胞因子、炎症因子和趋化因子，这些介质又可作用于ASMCs对细胞的增殖、凋亡进行调节。ASMCs在哮喘的发病及进展中扮演很重要的角色。IL-10在哮喘中的作用比较明确，IL-10对气道炎症起抑制作用。因IL-19与IL-10具有同源性，推测 IL-19也具有和 IL-10相似的生物学活性［2-4］。关于 IL-19的生物学作用尚存在争议。IL-19对哮喘的具体作用尚无相关报道。

本实验通过制备大鼠哮喘模型，培养大鼠叶支气管ASMCs，用不同浓度的IL-19干预细胞生长，观察ASMCs的增殖的变化。探讨IL-19对体外培养的哮喘平滑肌细胞增殖中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料

卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、Ⅰ型胶原酶（collagenase）为美国 Sigma公司产品；DMEM培养基（Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物所）；小鼠抗α平滑肌肌动蛋白（α-actin）单克隆抗体购自博士德公司；白细胞介素-19（IL-19）购自美国Peprotech公司。余为进口或国产试剂，分析纯。

1.2 方法

1.2.1 大鼠哮喘模型的建立 健康雄性 W istar大鼠，体重200～250 g，由山西医科大学实验动物中心提供［SCXK（普）070101］。适应性喂养1周后，第1天大鼠腹腔注射含100 mg OVA和200 mg氢氧化铝的生理盐水1 m L，同时腹腔注射百日咳杆菌疫苗1 m L（约6×109个菌株）作为佐剂，第8天重复致敏1次，第15天开始激发，将大鼠置于特制玻璃容器内，用超声雾化器喷入2％OVA生理盐水50 m L，激发30 m in，每天1次，激发8周。激发后大鼠出现烦躁、呛咳、呼吸加快及轻度紫绀等哮喘发作症状。正常大鼠以等量生理盐水代替OVA注射，并吸入生理盐水50 mL8周。

1.2.2 ASMCs的分离、培养及鉴定 参照 Johnson等［5］的培养方法，上述大鼠腹腔注射25％乌拉坦（4 m L/kg）麻醉后，开胸迅速取出肺脏置于预先冰浴的D-hanks’溶液，在解剖显微镜下仔细分离出叶支气管，并将支气管外膜剥离干净，刮除内皮，将获得的单层ASM在青霉素小瓶中剪成1 mm×1 mm的小块后，加入1 g/LⅠ型胶原酶，37℃，5％CO2培养箱中消化1 h后加入DMEM液，混匀后用金属滤网过滤，滤液置离心管内1000 r/m in离心6 min。弃上清后，沉淀的细胞用含20％FBS、青霉素100 U/m L、链霉素100 U/m L的DMEM培养液重悬，接种到培养瓶内，让细胞贴壁生长。原代培养的细胞生长约7～10 d后融合。0.25％胰蛋白酶消化传代，以含10％FBS、青霉素100 U/m L、链霉素100 U/m L的DMEM培养液传代培养，每3～4d换液1次，约4～5 d细胞长满后传代，3～8代的细胞用于实验。小鼠平滑肌α-肌动蛋白（α-actin）免疫细胞化学染色鉴定为ASMCs［6］。

1.2.3 实验分组 取第3～8代培养的大鼠气道平滑肌细胞，0.25％胰蛋白酶消化，台盼蓝染色法计数，细胞存活率大于96％。用含10％FBS的DMEM培养，待细胞90％融合后，换无血清DMEM培养24 h，使细胞生长同步于 G0期，换用含 10％FBS的DMEM液，随机分为5组：（1）对照组：培养的正常大鼠ASMCs，每孔/瓶中不加任何干预；（2）哮喘组：培养的哮喘大鼠ASMCs，每孔/瓶中不加任何干预； （3）、（4）、（5）组分别为不同浓度的 IL-19干预组：培养的哮喘大鼠 ASMCs，每孔/瓶中分别加入终浓度为1μg/L、10μg/L、100μg/L的 IL-19放入 CO2培养箱中共培养12 h，进行下述实验。每4个复孔/瓶为一组，实验重复3次。

1.2.4 细胞增殖检测

1.2.4.1 流式细胞仪分析 ASMCs细胞周期：

ASMCs按106/m L的密度接种于100 cm2的培养瓶，培养及分组如前述，收集的ASMCs用PBS液配制成浓度为1×106个/m L的细胞悬液，用预冷的75％乙醇固定，加入 RNA酶、碘化丙啶室温作用后，用FACSort型流式细胞仪（美国BD公司）Cellquest软件分析细胞周期中各期所占的百分比。

1.2.4.2 四甲基偶氮唑蓝（MTT）微量比色法测定ASMCs增殖： 96孔板内的ASMCs培养结束时，每孔加MTT（5 g/L）20μL，培养4 h后去培养液，加二甲基亚砜150μL振荡30 min，使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪于490 nm处测定各孔A值。

1.2.5 统计学方法 应用统计分析软件包SPSS13.0进行统计学分析。实验数据以均数±标准差表示。组间差异显著性检验采用方差分析，两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞鉴定

在倒置显微镜下，经原代培养的 ASMCs呈梭形，有较长的突起，圆形的细胞核位于细胞中央，呈疏密相间、典型“峰和谷”生长状态（彩插2图1）。α-actin免疫细胞化学染色，免疫反应产物呈棕黄色。97％细胞α-actin染色阳性，所培养的细胞为平滑肌细胞［6］（彩插2图2）。

2.2 流式细胞仪分析 ASM Cs细胞周期

与对照组ASMCs比较，哮喘组ASMCs的G0/G1期细胞所占比例明显减少（P＜0.01），S期细胞所占比例增高（P＜0.01），表明处于有丝分裂期的细胞数目增多。而加入不同浓度 IL-19共培养 12 h后，10μg/L、100μg/L IL-19干预组 S期细胞所占比例较哮喘组都明显下降（P＜0.01），但仍高于对照组（P＜0.01）（表1和图3）。同时这两个浓度IL-19干预组ASMCs的G0/G1期细胞所占比例较哮喘组明显增高（P＜0.01），但仍低于对照组（P＜0.01）。且上述两个指标两个浓度干预组间比较有差异（P＜0.01）。但1μg/L IL-19干预组以上指标与哮喘组并无统计学差异（P＞0.05）。

2.3 M TT检测ASM Cs增殖

与对照组相比，哮喘组ASMCs A值显著增加（P＜0.01），10μg/L、100μg/L IL-19干预组ASMCs A值较哮喘组相比均显著降低（P＜0.01），但仍高于对照组（P＜0.01）（表1和图4）。而1μg/L IL-19干预组ASMCs A值与哮喘组并无统计学差异（P＞0.05）。

图3 流式细胞仪分析各组大鼠气道平滑肌细胞周期Fig.3 Analysis of cell cycle of ASMCs by flow cytometry

表1 IL-19对哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖的影响（n=3）Tab.1 IL-19effect on cell proliferation of ASMCs in asthmatic rats（n=3）

图4 MTT法检测各组大鼠气道平滑肌细胞的增殖A：对照组 B：哮喘组 C：1μg/L IL-19组D：10μg/L IL-19组 E：100μg/L IL-19组注：*P＜0.01与对照组比较；#＊＊P＞0.05与哮喘组比较；#*P＜0.01与哮喘组比较Fig.4 Proliferaion of ASMCs were detected by MTT A：Control group；B：Asthmatic group；C：1μg/L IL-19 group；D：10μg/L IL-19 group；E：100μg/L IL-19 group.Note：*P＜0.01 compared with control group；#＊＊P＞0.05compared with asthmatic group；#*P＜0.01 compared with asthmatic group

3 讨论

支气管哮喘是一种由多种炎症细胞、炎症介质和细胞因子共同参与并相互作用的气道慢性炎症性疾病。在气道炎症中，气道平滑肌细胞（ASMCs）不仅有收缩功能，而且有合成分泌炎症介质的功能。ASMCs在哮喘气道炎症、气道高反应性与气道重构中有重要作用。多种炎症介质和炎性细胞产物又可作用于ASMCs，对ASMCs的增殖进行调节。增殖的ASMCs使气道壁增厚，导致基础气道阻力增加和不可逆性气流受限的发生。

白细胞介素-19（IL-19）是新近发现的 IL-10超家族成员中的一员。IL-10被广泛认为是系统性的抑制炎症反应的细胞因子［7］。因 IL-19与IL-10具有同源性［8］，推测IL-19也具有和IL-10相似的生物学活性。关于IL-19的生物学作用尚存在争议。在Sommerville［9］研究IL-19对受损血管平滑肌的作用过程中，发现在它可使受损血管平滑肌增殖减少。但它对哮喘大鼠气道平滑肌细胞的作用目前还尚无报道。实验结果表明：一定浓度 IL-19可使慢性哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖减弱，处于增殖期的细胞数目减少。提示IL-19对体外培养的哮喘气道平滑肌细胞有抑制增殖的作用。这与IL-19可使受损血管平滑肌增殖减少的报道一致。我们还发现随着IL-19干预浓度的增高，处于增殖期的细胞比例逐渐减少但仍高于正常对照组，提示可能所选择的IL-19干预浓度仍较低，或者ASMCs上还可能存在其它类型的促进细胞增殖的信号转导通道，有待进一步研究。

以上实验结果表明，一定浓度的 IL-19可以抑制哮喘大鼠ASMCs的增殖。目前对于已形成的气道重塑当前尚无特效药物，大力加强防治哮喘气道重塑药物的研究势在必行，本课题为哮喘的防治提供了新思路。关于IL-19抑制哮喘气道平滑肌细胞增殖的具体机制还未完全阐明，有待进一步研究。

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