达泽蛟，祝秉东，张颖

1. 兰州大学结核病研究中心暨病原生物学研究所，兰州 730000; 2. 美国约翰·霍普金斯大学布隆博格公共卫生学院分子微生物学与免疫学系，马里兰州 21205

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)是一种顽固的病原体，已感染全世界1/3人口。每年有约900万例新发结核病患者，近200万例死于结核病[1]。随着越来越多耐药菌株的出现，特别是耐多药(至少对2种一线抗结核药物异烟肼和利福平耐药)和广泛耐药(在耐多药的基础上，又对2种主要的二线抗结核药物氨基糖苷类和氟喹诺酮类药物耐药)菌株的出现，给结核病的控制带来了巨大挑战[2]。由于人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染、社会经济影响(如部分地区经济发展落后、个体营养状况差)、精神及躯体压力等因素，宿主免疫力低下，最终使处于潜伏期的结核分枝杆菌活化或导致部分个体再感染[3]。这使得当前结核病疫情愈加严峻。

目前，结核病疫情与其化疗药物和卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)的有效性形成矛盾。导致该结果的主要因素包括：结核病需要长期服药和结核分枝杆菌耐药，特别是结核病控制策略没有充分考虑到结核分枝杆菌的潜伏感染。BCG不能提供有效的免疫保护力来抵抗结核分枝杆菌的感染，尤其不会对处于潜伏期的结核病患者产生任何效果。每年900万的新发结核病例，在某种程度上反映了这个问题。结核分枝杆菌的潜伏感染就像一颗定时炸弹，已成为结核病防治的一大隐患。当机体免疫力低下时(如HIV感染、麻疹、营养不良、情绪低落等)，潜伏的结核分枝杆菌感染就可能转化为活动性结核病[4]。因此，对于结核病防治，必须兼顾针对活动期和潜伏期的结核分枝杆菌感染。本文将围绕结核病免疫发病机制的研究进展，讨论如何将其用于新疫苗研制，同时对当前新疫苗研发的进展作一综述。

1 结核病免疫机制

当人吸入结核分枝杆菌后，30%个体会被感染。感染个体中，90%处于潜伏期，不到10%发展为活动性结核。处于潜伏感染期的个体，一生中有不到10%的概率发展为活动性结核病。导致以上变化发生的危险因素包括宿主的易感性、社会经济发展落后、年老及其他原因导致的免疫力低下。如HIV感染者发展为活动性结核病的概率每年>10%[5]。

结核分枝杆菌经呼吸道引起肺部感染，在机体建立免疫力前被肺泡巨噬细胞吞噬，并在其中增殖。机体在抗结核免疫反应作用下，细胞及组织病理损伤表现为典型的干酪样坏死，参与的各种免疫细胞包括巨噬细胞、树突细胞、中性粒细胞和淋巴细胞，并构成结核肉芽肿。在机体免疫反应作用下，结核分枝杆菌停止增殖，病理损伤有所局限。但不是所有结核分枝杆菌都被杀死，在机体免疫力低下时又会增殖。干酪样损伤进一步液化，流入血管引起血行播散，形成粟粒型肺结核和肺外结核(如结核性脑膜炎)。病灶液化可侵入气道形成结核空洞，大量结核分枝杆菌在空洞增殖、生长，并通过呼吸道进行传播[6]。

结核分枝杆菌通过补体受体3(complement receptor 3，CR3)[7]、甘露糖受体(mannose receptor，MR)和清道夫受体(scavenger receptor，SR)[8]被巨噬细胞吞噬，形成吞噬体(图1)。吞噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，溶酶体中的酶再降解结核分枝杆菌的蛋白及其他成分，该过程称为自噬，是天然免疫的一部分。但结核分枝杆菌通过分泌酸性磷酸酶(secreted acid phosphatase，SapM)[9]、蛋白激酶G(protein kinase G，PKG)[10]和糖基化磷脂酰肌醇等来抑制吞噬体与溶酶体的融合[11]。SapM是一种分泌型类脂磷酸酶，能水解磷脂酰肌醇-3-磷酸(phosphatidylinositol-3-phosphate，PI3P)。PI3P是位于吞噬体膜表面的一种运输调节脂类，为吞噬体与溶酶体融合所必需[9]。吞噬体中的结核分枝杆菌清除PI3P，能阻止吞噬体与溶酶体的融合。另外，结核分枝杆菌细胞壁成分脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)可模仿哺乳动物磷脂酰肌醇阻止磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)及其产物PI3P，从而抑制吞噬体发展为吞噬溶酶体，使结核分枝杆菌存活[11,12]。PKG类似于真核细胞的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase，Akt)，与抑制吞噬体与溶酶体融合有关[10]，但确切机制及其宿主靶位还不清楚。最近研究表明，T辅助细胞1型(T helper cell type 1，Th1)相关细胞因子——γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)能促进吞噬体与溶酶体融合，并通过干扰素诱导蛋白1(interferon-inducible Golgi membrane associated GTPase，Irgm1/LRG-47)[13,14]和PI3K[15]细胞信号转导通路发挥作用。然而Th2相关细胞因子——白细胞介素4(interleukin 4，IL-4)和IL-13可通过Akt信号途径终止自噬功能和自噬介导的杀菌作用。此外，IL-4和IL-13通过信号转导和转录激活子6(signal transducer and activator of transcription 6，STAT6)转录因子抑制IFN-γ诱发的自噬作用[16]。除吞噬作用相关的细胞信号转导，结核分枝杆菌19kD脂蛋白、脂化甘露聚糖、磷脂酰肌醇甘露糖苷和核酸与巨噬细胞表面Toll样受体2(Toll-like receptor 2，TLR2)、TLR4、TLR9等模式识别受体相互作用，通过髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)、IL-1 I型受体相关蛋白激酶激活TLR介导的细胞信号转导通路，导致核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)活化入核，促进肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、IL-12表达和一氧化氮(nitric oxide，NO)等生成增多[17]。此外，TLR2活化激活巨噬细胞维生素D受体和维生素D-1-羟化酶基因，最终分泌抗菌肽以杀死细胞内的结核分枝杆菌[18]。

图1 结核分枝杆菌与宿主细胞在巨噬细胞水平的相互作用

Fig.1Mycobacteriumtuberculosis-host cell interaction at macrophage level

感染的巨噬细胞和树突细胞分泌各种细胞因子，包括IL-12、IL-23、IL-7、IL-15、TNF，并呈递各种抗原给CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD1限制性T细胞(识别脂质抗原)和γδT细胞(图2)[19]。活化的T细胞分泌IFN-γ，与TNF共同激活巨噬细胞，通过活性氮、活性氧介导，杀死胞内的结核分枝杆菌。另外，CD8+细胞毒性T细胞分泌颗粒溶素、穿孔素，杀死胞内结核分枝杆菌。但CD4+Th2产生的IL-4和CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)产生的IL-10和转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)抑制IFN-γ介导的杀结核分枝杆菌作用[20-22]，有效下调炎症反应，从而有助于结核分枝杆菌生存。另有研究发现，结核分枝杆菌甘露糖末端修饰的LAM可刺激Treg分泌免疫抑制因子IL-10和TGF-β[23]。近几年来，对以分泌IL-17为特征的新T细胞亚群Th17的研究表明，Th17是重要的炎症反应和CD4+T细胞免疫反应的调节者[24]。Th17分泌IL-17并募集中性粒细胞、单核细胞。CD4+T细胞分泌IFN-γ，刺激趋化因子表达[24]。但IFN-γ亦能抑制Th17分泌IL-17，有利于限制结核分枝杆菌诱导的免疫病理损伤(图2)[25]。虽然近几年免疫学发展迅速，但目前对干酪样坏死及液化的机制仍不清楚。

图2 结核分枝杆菌感染的免疫反应

Fig.2 Cellular immune response toMycobacteriumtuberculosisinfection

2 BCG存在的问题

BCG是Calmette和Guérin将牛型结核分枝杆菌经过230次传代培养，历时13年(1908～1921年)所研制的减毒分枝杆菌。BCG是目前应用最广泛的结核分枝杆菌疫苗，已接种76%新生儿。它能降低小儿患严重结核性脑膜炎及粟粒型肺结核的风险，保护70%～80%的新生儿；但其保护效应不稳定，尤其对患肺结核的成人保护力较差。如在南印度Chingleput地区，BCG的保护率为0%；而在英国学龄儿童中保护率可高达80%[26,27]。尽管BCG得到广泛应用，但面对全球结核病疫情的蔓延却无能为力。因为作为一种预防性疫苗，它不能有效治疗结核分枝杆菌的潜伏感染。此外，由于BCG仍存在一定毒力，免疫力低下的儿童(多为先天性免疫缺陷)接种BCG后可引起结核病样的BCG疾病(经血行及淋巴播散全身)。

BCG缺乏有效性的确切原因还不清楚，可能与以下因素有关[27]：BCG菌株多样，不同菌株的免疫原性可导致不同的保护效应；BCG菌株可能在反复的体外培养中丢失了一些重要的抗原；也可能与宿主的遗传因素有关；环境分枝杆菌的感染可能掩盖BCG的保护力；最近研究显示BCG与临床致病结核分枝杆菌有很大不同，如BCG对流行的临床菌株北京株缺乏有效作用[28]；还可能与寄生虫感染增强Th2反应和Treg减弱BCG的保护效应有关[29]。

3 新疫苗

由于现有的BCG存在很多问题，因此寻找新的疫苗尤为重要[19,26,30,31]。总的来说，处于现研究阶段的疫苗可分为3类：暴露前疫苗(预防为主)、暴露后疫苗(针对潜伏感染活化)和治疗性疫苗(可提高化疗的疗效，增强杀菌效果)。

当前候选疫苗也可分为BCG替代疫苗和亚单位疫苗[19,26]。BCG替代疫苗包括表达结核分枝杆菌抗原Ag85和38kD的重组BCG，重组李斯特菌溶素(listeriolysin)[32]或产气荚膜梭菌溶素(perfringolysin)(http://www.aeras.org)的BCG，以及减毒活疫苗(结核分枝杆菌leuD、panCD、lysA、RD-1、phoP和mce2/3的突变体)[33-35]。亚单位疫苗包括蛋白疫苗(使用新型佐剂的融合蛋白Mtb72f、Ag85-ESAT6、Ag85-TB10.4)、表达结核分枝杆菌抗原(如Ag85A)的病毒载体疫苗(痘病毒和腺病毒)[36,37]和DNA疫苗(HSP60、Ag85)[26,38]。表1列出了一系列处于不同研发阶段的结核候选疫苗。其中进展最快的为MVA85A(表达Ag85A的Ankara改良痘苗病毒)，用于强化BCG免疫，已进入临床Ⅱ期试验[39]。早期分泌抗原靶蛋白6(early secretory antigenic target 6，ESAT6)已作为诊断抗原，用以区别BCG免疫和结核分枝杆菌感染。因此，在各种研发的疫苗中，含有ESAT6的候选疫苗可能给结核病的诊断带来困难[40]。

表1 处于不同研发阶段的主要候选疫苗

Tab.1 Current tuberculosis vaccine candidates

Vaccine candidateDeveloperStageDescriptionAeras 422AerasClinical ⅠOverexpression of selected antigens and endosome escape to enhance antigen immunogenicityBCG::RD1Institut PasteurPreclinicalRecombinant BCG with reintroduction of RD1 and expressing antigens ESAT6 and CFP10rBCG::ΔureC-hlyMax Planck InstituteClinical ⅠUrease-deleted recombinant BCG expressing listeri-olysin from Listeria monocytogenesAttenuated MtbAlbert Einstein College of MedicinePreclinicalMtb with double deletion of lysA/panCD and RD-1/panCD Mtb ΔphoPInstitut PasteurPreclinicalMtb with inactivation of phoP by inserting a drug-resistance geneMVA85AOxford UniversityClinicalⅡA recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA) containing Mtb antigen 85AAeras 402 / Crucell Ad35Crucell N.V./AerasClinicalⅡA replication-deficient adenovirus Ad35 containing Mtb antigens 85A, 85B, and TB10.4Mtb72FAeras/GlaxoSmithKlineClinicalⅡA fusion protein of Rv1196 and Rv0125 in adjuvant AS01 or AS02H1-CAF01Statens Serum Institut Clinical ⅠA fusion protein of 85B and ESAT6 in adjuvant CAF01H1-IC31Statens Serum Institut Clinical ⅠA fusion protein of 85B and ESAT6 in adjuvant IC31SSI/SP H4-IC31Statens Serum Institut /AerasClinical ⅠA fusion protein of 85B and TB10.4 in adjuvant IC31

Mtb,Mycobacteriumtuberculosis.

目前，BCG和重组BCG初次免疫后再用亚单位疫苗加强免疫的免疫策略被人们所接受[19,26,36]。巴西的研究表明[41]，反复接种BCG不能增强BCG的保护效果，即增加接种BCG次数也不能提高疫苗本身的效果。

4 疫苗佐剂

各型疫苗的研发主要集中在抗原筛选方面，但仅考虑抗原是远远不够的，因为单个抗原所引起的免疫效应有限，需合适的佐剂提高其免疫效应和保护力。因此，新一代结核蛋白亚单位疫苗需要寻找一个理想的佐剂。70多年来，铝佐剂是唯一一个在世界范围广泛应用的注册佐剂。另外，MF59在一些国家作为预防流行性感冒(简称流感)和甲型肝炎疫苗的佐剂，已经注册[42,43]。但以上2种佐剂主要介导体液免疫，对以细胞免疫为主的结核疫苗效果不佳。结核分枝杆菌与HIV的合并感染已成为世界公共卫生问题，这2种疾病都以细胞免疫为特点，但现有疫苗缺乏理想的针对细胞免疫为主的佐剂。

近几年来，随着佐剂技术的发展，一系列能诱导较强细胞免疫的佐剂已进入临床试验。如Ag85B-TB10.4、Ag85B-ESAT6和Mtb72F融合蛋白分别在一种阳离子多肽﹝KLKL5KLK与寡脱氧核苷构成的佐剂(IC31)和由单磷酰脂A和皂角苷QS-21构成的水-油乳浊液(AS02A) ﹞介导下，可诱导有效的细胞免疫反应，并具有免疫保护效应[44,45]。由阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵(dimo-thylidioctyl ammonium bromide，DDA)和trehalose 6,6-dibehenate (TDB)构成一种新型的复合佐剂CAF01，可辅助结核融合蛋白Ag85B-ESAT6诱导较强的细胞免疫效应。TDB为结核分枝杆菌细胞壁索状因子(cord factor)类似合成物，动物实验显示其保护效果较理想，已进入Ⅰ期临床试验[46]。从以上不难看出佐剂发展的一个趋势，即单个成分的佐剂可能被复合佐剂所取代。单个佐剂的免疫效应有限，且不同佐剂之间各有特点，所以合理搭配不同的佐剂已成为研发新型佐剂的趋势。一些新技术的应用(如纳米技术)也推动了佐剂发展，如以聚乳酸-羟基乙酸共聚物﹝poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA﹞为载体的佐剂联合融合蛋白TB10.4-Ag85B，能增强T细胞免疫反应[47]。

虽然佐剂技术有了长足进步，但寻找一个安全、稳定和有效的佐剂，仍需要大量的研究和时间检验。

5 疫苗评价

抗结核疫苗的保护效率通常以免疫原性、结核菌载量(bacterial load)和感染动物的生存时间来评价[19,26]。免疫原性的实验指标包括与保护相关的细胞因子(如IFN-γ、IL-2和TNF-α)分泌量和活化的T细胞数目(CD4+和CD8+T细胞)。评价结核疫苗的保护效率是一项十分复杂的工作，牵涉诸多因素，包括不同的动物模型(小鼠、豚鼠、兔和灵长类动物)，不同的免疫途径(皮内、皮下、腹膜内、肌内、鼻内、气溶胶和口腔)，不同的剂量(低、中、高)，不同的间隔时间和加强次数(4周、6周、8周)，不同的毒力菌株(Erdman、H37Rv、临床株)，不同的毒株攻击剂量(低、中、高)，不同的感染途径(气溶胶、静脉)，从感染到检测时间间隔(4周、6周、8周)和不同的判断标准(动物生存状况、菌落形成单位、病理学和脾脏重量)。

在人体评价疫苗的免疫原性更复杂，因为能保护人体有关的免疫参数还未彻底搞清楚。不过，新方法的建立给疫苗筛选带来了启发。如从已注射疫苗动物体内分离T细胞，与巨噬细胞进行体外结核分枝杆菌抑制检测。最近Ⅱ期临床试验表明，BCG初次免疫后用MVA85A强化可诱导较高的细胞免疫反应， IFN-γ和TNF-α分泌增多，并诱导可分泌IL-2的记忆性T细胞[39]，但其保护效果仍有待观察。然而，南非的研究发现，新生儿接种BCG 2年后，CD4+T细胞分泌IFN-γ的水平与免疫保护效果并不相关[48]。

新疫苗的临床试验花费巨大，耗时较长，在整个临床试验阶段，评价体系又不够精确，因此新疫苗的临床前研究至关重要。如果能在实验室尽可能系统地评价出理想的新疫苗，就有可能避免临床试验时不必要的浪费，节省大量的资金和时间。合适的动物模型是首先要考虑的问题。不同动物对结核分枝杆菌的敏感性不同，不同动物针对结核分枝杆菌的免疫特点也不同(如小鼠感染结核分枝杆菌后可诱导明显的细胞免疫，但不能形成典型的干酪样坏死病变，而豚鼠恰好相反)。因此，长期以来作为结核免疫研究对象的兔模型，已得到很多学者的重视。有研究表明，兔模型在筛选疫苗方面可能有更好的优势。为避免不同动物模型的局限性，尽可能选择多个动物模型，最后综合评价，也许是不错的办法[49]。

目前，许多实验室都选择H37Rv标准株作为毒力攻击株，这也存在很大的局限性，或许应该选择一些临床菌株如北京株。最好在进行流行病学调查的基础上，选择当地的优势菌株进行毒力攻击实验，这可能更有临床意义[50]。

6 合理的疫苗研发策略

长期以来，人们普遍认为Th1型细胞因子IFN-γ能保护机体抵抗结核病，但过强的Th1型免疫反应会引起组织病理损伤。Th2反应和Treg抑制Th1反应能阻止组织损伤，但会导致结核分枝杆菌存活[16,22]。如何在两者之间找到平衡，在保护组织、局限组织损伤的同时，也能限制甚至杀死结核分枝杆菌，是理想疫苗设计的关键。Th2型细胞因子IL-4、IL-13对抗IFN-γ介导的免疫保护，减少TNF介导的感染细胞的凋亡和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的活动，增强Treg作用，提高TNF的毒性，故会减弱抗菌作用[22]。疫苗可能不仅需提高CD4的Th1反应，还要减弱Th2(IL-4)和Treg反应(IL-10、TGF- β)[22]。最近研究表明，重复接种可刺激Th1反应的候选疫苗可能导致随后向Th2反应发展。如有保护效果的Ag85B DNA疫苗经蛋白Ag85B加强后，免疫保护效果丢失。这可能是由于经过强化免疫后，免疫反应向Th2方向发展[51]。Ag85A DNA疫苗初次免疫能增强BCG的保护效果，但BCG免疫后用Ag85A的DNA、85A蛋白或MVA85A强化免疫不能增强BCG的保护力，相反可引起与病理相关的IL-17分泌[52]。

候选疫苗(rBCG::△ureC-hly、DNA疫苗、表达结核分枝杆菌抗原的病毒载体)刺激CD8+T细胞，能提供有效的保护力，抵抗肺结核的发生[32,37,38,53]。德国马普研究所依据宿主与病原体之间的免疫反应，设计了重组BCG(rBCG::△ureC-hly)，从BCG剔除了尿素酶基因以防尿素酶碱化吞噬小体空泡，而酸化空泡可利于吞噬小体与溶酶体的融合。此外，该BCG变异株表达来自于李斯特菌的溶菌素基因，导致吞噬小体溶解，更有效地通过主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类分子呈递抗原给CD8+T细胞。同时，使已感染的巨噬细胞凋亡，树突细胞摄取其裂解物，反过来进行更有效的抗原呈递，整个过程称交叉致敏[32]。人们依据产气荚膜梭菌溶素研制了一个类似的疫苗。

新型佐剂IC31已用于重组结核分枝杆菌Ag85B和TB10.4蛋白，可有效刺激T细胞和B细胞[44]。此外，佐剂AS02与蛋白亚单位疫苗Mtb72F能诱导Th1免疫反应(表1)[45]。

BCG缺乏RD1区域，已表明将该区域基因互补入BCG能提高其保护力[54]，但是否会增强BCG的毒力还有待进一步评价。PhoP是结核分枝杆菌的一个重要毒力致病因子，结核分枝杆菌减毒株H37Ra株毒力降低与phoP基因突变密切相关。phoP突变株亦可能是一个有希望的候选疫苗[34]。最近，H37Ra基因组测序已经完成[55]，有可能以H37Ra株为参照研制出新的减毒活疫苗。

利用处于休眠期的蛋白研制针对潜伏感染的疫苗，引起了人们的浓厚兴趣。人们设计了表达休眠相关基因如DosR调节蛋白的重组BCG(表1)[56]或基于DosR蛋白设计亚单位疫苗[57,58]。最近有研究报道，将结核分枝杆菌休眠期抗原Rv2660c和Ag85B、ESAT6融合制备的疫苗既具有预防性疫苗的作用，还可有效预防潜伏感染结核分枝杆菌的复活[59]。

7 结核病疫苗发展面临的挑战

结核病疫苗的发展面临诸多挑战，如缺乏预测临床保护效果的替代指标，这将是疫苗研发的巨大障碍。Ⅲ期临床试验需花费很长时间(3～4年，甚至更长)和大量患者，试验成本昂贵。更重要的是，缺乏临床试验场所。不过，最近Aeras全球结核病疫苗基金会正在印度、南非、肯尼亚和乌干达等地建立试验场地(http://www.aeras.org)，包括欧洲和发展中国家的合伙人也正在增建临床试验场地，这些将为结核疫苗的最终应用奠定基础。

8 展望

在结核疫苗的发展研制过程中，出现了很多有趣的问题。许多候选疫苗正在进行临床前研究，有几种已经进入临床Ⅰ期或Ⅱ期试验研究。Aeras全球结核病疫苗基金会受比尔·盖茨及梅林达·盖茨基金会资助，将在肺结核病防治中发挥重要作用，有望在未来几年内开发出能控制结核病疫情的新疫苗 (http://www.aeras.org)。但依然有很多不确定的因素，如动物研究中有效的候选疫苗在人体是否同样有效？所以，有必要进一步探索与人体保护效果有关的人体免疫参数或生物标记，然后用多参数分析复杂的免疫系统。对比分析结核病患者和纯化蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)阳性健康对照的免疫反应，同时动态、长时间监测处于潜伏期感染的个体免疫参数，尤其是发展为结核病和最终未发展为结核病的个体参数，可揭示免疫系统(包括固有免疫和获得性免疫)抗结核及控制潜伏感染的机制。这将使人们不仅更深入了解宿主针对结核分枝杆菌的免疫保护反应，还有助于研发更有效的疫苗。为能更好地控制结核病，不仅需要快速诊断和较短时间的化疗，更重要的是需要一种优于BCG或可强化BCG的疫苗即接触前疫苗，还需要针对结核分枝杆菌潜伏感染的治疗性疫苗。

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