王晶晶，李薇，赵红玲，刘龙丁，唐东红, 杨丽仙, 董承红，纳锐雄，王丽春，张莹，梁燕，廖芸，李琦涵

1. 中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所，云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，昆明 650118； 2. 昆明医学院，昆明 650032

作为小RNA病毒科肠道病毒属的成员之一，肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)虽已得到深入的病原学研究[1]，但其在人群中的传播规律尚未明确[2]。以往报道均认为，由于EV71具有肠道病毒的生物学特性，其传播为粪-口途径[3,4]。但更多的流行病学及病原学研究提示，该病毒可经食物、呼吸道或通过接触而在人群中传播[5]。同时，流行病学的分析基于该病毒能在人群，尤其是在感染性儿童群体，如幼儿园、小学中迅速蔓延的现象，提示其经污染的空气、飞沫而通过呼吸道及消化道传播的可能[6]。对其他肠道病毒如脊髓灰质炎病毒的研究显示，肠道病毒事实上可经消化道和呼吸道传播，并能首先在消化道或呼吸道黏膜上皮及淋巴组织中增殖[7]。此类肠道病毒感染的个体不仅能通过粪便，亦可通过咽部分泌物排出病毒[8]。这些资料为进一步探索EV71在人群中传播的特点奠定了基础。有关EV71感染的动物学模型研究亦表明，通过不同途径使小鼠或猕猴感染 EV71所产生的病理学表现有一定差异[9-11]。我们在前期工作中，初步建立了恒河婴猴EV71实验性感染模型，通过不同感染途径的分析，提出EV71感染恒河猴亦以呼吸道途径为主的可能机制。这些工作中的相关感染病理学、病原学分析提示，EV71可能在黏膜被单核类细胞吞噬并携带至颈、腋下及气管周围的淋巴结，以尚不清楚的机制在其中增殖，然后进入血液循环，感染外周神经、棕色脂肪、肌肉及相关神经组织，并在一定情况下引起中枢神经系统感染[7]。此类感染通常在恒河婴猴肺部引起炎性反应，表现为轻至中度的间质性肺炎及支气管炎。这样一个基本完整的感染过程为分析EV71在恒河猴模型中的感染、传播等机制提供了一些客观的病理学和病原学指征[12]，如感染后动物出现典型的肢体、口腔黏膜疱疹，感染后3～9 d体温升高，以及出现病毒血症等；另外，咽部及粪便排毒也可作为研究该模型具有传染能力的线索[7]。基于以上结果，本文进一步研究了EV71在恒河婴猴感染个体向其他未感染个体传播(次代感染)的可能性，并对这种可能性的相关生物学意义做了初步分析。

1 材料和方法

1.1 材料

使用的毒株EV71 FY-23来源于2008年5月中国阜阳地区1名临床出现严重心肺衰竭症状的手足口病男性患儿的咽部分泌物，病毒液经0.2 μm滤器过滤后接种Vero细胞(来自荷兰RVIM研究所，保存于中国医学科学院医学生物学研究所，使用代次为145～150)，收获感染EV71的Vero细胞并连续传代，第4代起的病毒用于实验。Vero细胞生长于含5%小牛血清的DMEM，待细胞在T-75培养瓶或96孔板内形成单层后备用。

1.2 方法

1.2.1 病毒效价测定 将收获的病毒液按常规进行对数稀释[13]，以100 μl/孔加于96孔平底培养板，每个稀释度接种8孔，随后按每孔1×104个细胞/100 μl培养液加入Vero细胞。第3、5、7天观察并记录病变，超过50%细胞病变的孔判为病变阳性。

1.2.2 中和抗体效价测定 恒河婴猴逐日采血，分离血清后检测中和抗体效价。血清样品56 ℃灭活30 min，以2% MEM样品稀释液倍比稀释，37 ℃放置1 h；按50 μl/孔加入96孔平底培养板，每孔的EV71细胞培养半数感染量(cell culture infective dose 50%，CCID50)为100，再按每孔1×104个细胞/100 μl培养液加入Vero细胞。同时，设血清对照组、病毒对照组、细胞对照组。每天观察各对照组及实验组细胞的病变情况，实验组以不出现病变的最高血清稀释度为该血清的中和抗体效价。

1.2.3 实验用恒河婴猴及病毒感染方法 实验使用6只平均体重(1.0 ± 1.3)kg、平均年龄1.5个月的健康婴猴。婴猴均随其母猴单笼喂养，按照实验动物标准操作规程饲养。在实验开始前2周开始隔离，此时采集血样，检测实验猴的EV71抗体，保证所有实验猴在实验前EV71抗体均为阴性。取组织培养制备的EV71 104.5CCID50，通过喷雾形式经呼吸道感染2只婴猴(A组)。于感染后7 d取A组婴猴粪便0.5 g，重悬于1 ml磷酸缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)。经沉淀、离心及过滤除菌处理后，取上清液0.5 ml，以喷雾形式经呼吸道感染2只新的婴猴(B组)。同时收集A组婴猴粪便，处理后取上清液经血液途径感染2只婴猴作为对照，并对哺乳B组婴猴的母猴(C组)也进行全面的临床观察。

1.2.4 病毒感染动物的临床观察及临床样本的收集 感染后21 d内，每天通过肛门监测猴体温2次，进行临床观察并记录；每天取抗凝血0.3 ml、粪便0.5 g和咽拭子。

1.2.5 感染动物样本中病毒RNA的提取 提取血液中总RNA：每天取抗凝血200 μl，加入800 μl TRNzol-A+，按天根生化科技有限公司TRNzol-A+总RNA提取试剂说明书操作。

1.2.6 实时聚合酶链反应检测病毒载量 利用EV71 FY-23株(GenBank系列号：EU812515)基因序列VP1保守区设计引物及探针：Vp1f(2 371～2 390)：5′-AGCCCAAAAGAACTTCACTA-3′；Vp1r(2 531～2 541)：5′-ATCCAGTCGATGGCT- GCTCA-3′；Probe (2 411～2 438)：5′-FAM-AGTG- ATATCCTGCAGACGGGCACCATCC-TAMRA-3′。实时聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)的反应体系及反应条件按TaKaRa公司 One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit试剂盒说明书操作。同时，将浓度分别为105、104、103、102、101、100、10-1拷贝/μl的EV71 RNA标准品加入同一反应板中进行PCR反应。

1.2.7 组织病理学检查 感染后第10天，电击将猴处死，分别采取大脑，小脑，延脑，中脑，脊髓颈、胸、腰段，心，肝，脾，肺，肾，胰，淋巴结等组织，经固定、脱水、包埋、切片、HE 染色，观察结果。

1.3 统计学处理

采用SPSS 11.0 软件分析。

2 结果

2.1 EV71感染婴猴与其次代感染婴猴的临床表现

结果表明，A组和B组婴猴呈现相似的临床表现，在感染后4～9 d出现肢体及口腔黏膜的疱疹性病变(图1)、体温升高等(表1)。值得注意的是，2组动物均未出现典型的神经系统症状，仅个别动物出现轻度可逆的肢体肌张力下降，但该表现缺乏明确的定量标准，这与我们先前的研究结果类似[7]。同时C组作为成年恒河猴，未观察到明显的临床表现(表1)。

2.2 次代感染婴猴的病毒血症特征

检测感染后逐日提取的B组动物血液，发现与EV71直接感染的A组动物类似，B组动物在感染后的第3天即出现明显的病毒血症高峰(图2)，两者均表现相似的病毒载量。结果提示，对恒河婴猴模型而言，EV71直接感染动物引起的临床症状是由于病毒在体内相关增殖而导致的。结合前期的工作结果[7]，可以推断，EV71感染的恒河婴猴具有以排泄物形式向新的同类个体传播的传染病特征。有意思的是，C组动物亦在B组动物出现病毒血症后期，出现了一个病毒拷贝数水平较低的病毒血症峰值，提示受感染的次代婴猴可继续向其他个体传播。

A: Pathological changes in vesicular lesions in hand muscle in Group A (200×). B: Pathological changes in vesicular lesions in foot muscle in Group B (200×). C: Pathological changes in vesicular lesions in oral mucosa in Group B (200×). Typical pathological changes in respiratory apparatus (hand and foot muscle) of EV71-infected rhesus monkeys, such as infiltration of inflammatory cells, perivascular cuffing, edema, and hemorrhage, are shown. Samples were collected at day 7 post-infection. Histopathological examinations were performed on 4-μm sections of paraffin-embedded tissue or organ stained with HE according to protocol.

图1 EV71感染恒河婴猴肢体及口腔黏膜疱疹的病理学改变

Fig.1 Pathological changes in the mouth and feet of neonatal rhesus monkeys infected with EV71

表1 EV71感染恒河猴的临床表现

Tab.1 Clinical manifestation in EV71-infected rhesus monkeys

GroupMonkey IDClinical manifestationVesicular lesionsMouthHandFootBodytemperature*Muscular tensionMental statusFood intakeDiarrheaABCControl10YYY↑--+-11YNY↑+---32YNY↑----33YYY↑---+32MNNN-----33MNNN-----34YYN↑+-+-35YYY↑----

Note: Y, yes; N, no; +, abnormal; -, normal; *, the temperature was higher than normal body temperature ranging from 38 ℃ to 39 ℃.

Dynamic distribution of EV71 in infected rhesus monkey via respiratory route. The rhesus monkeys were challenged with EV71 (104.5CCID50per monkey). Viral RNA was extracted from blood specimens and measured by TaqMan-based real-time quantitative PCR.

图2 EV71感染恒河猴的血液病毒载量

Fig.2 EV71 viral loads in the blood of infected rhesus monkeys

2.3 次代感染婴猴的排毒特征

分析EV71原代及次代感染恒河猴的咽拭子和粪便中病毒载量，结果显示恒河猴能通过咽部和粪便向体外排毒(图3)，基本趋势类似。在咽拭子检测中，排毒高峰出现在感染后7～8 d，病毒载量差异不明显(图3A)。另外，对A组和B组动物粪便的逐日检查表明，B组的排毒高峰时间稍延后，约在感染后第10天，但咽部和粪便排毒时间均在病毒血症高峰之后(图3)。结果提示，EV71感染动物出现的病毒血症使其在靶器官的感染增殖成为可能，并随后排出。有意思的是，C组动物尽管在粪便排毒峰值时间上明显滞后于A、B组动物，但咽部排毒的峰值时间却与B组动物相似。

A: Viral loads in throat swabs of infected rhesus monkeys. B: Viral loads in feces of infected rhesus monkeys. Throat swabs and stool specimens were collected during the whole course of EV71 infection (1-23 d ).

图3 EV71感染恒河猴的咽拭子和粪便病毒载量

Fig.3 EV71 viral loads in the throat swabs and feces of infected rhesus monkeys

2.4 次代感染婴猴的特异性抗体反应

检测次代感染动物(B组)抗EV71特异性中和抗体，发现该组动物在感染后7 d可见一个弱的特异性中和抗体效价上升(图4)，抗体型别分析表明为IgM。在第14天左右出现第2个中和抗体效价峰值，抗体为IgG。与原代感染动物(A组)相似。呼吸道感染和血液感染途径表现出类似的免疫反应特征。C组动物仅见一个IgG的中和抗体峰值，出现在B组动物感染后的21 d后。

图4 EV71感染恒河猴中和抗体效价的比较

Fig.4 Neutralizing antibody titers as induced by EV71 infection in rhesus monkeys

2.5 次代感染婴猴的组织病理学特征

我们的前期资料表明，组织病理学检查中，经呼吸道感染的婴猴可在中枢神经系统见到明确的病理学变化，包括神经细胞坏死、退行性改变、炎细胞聚集、血管套状炎细胞聚集等；在肺部及支气管亦观察到以上皮细胞坏死、肺泡结构破坏和炎细胞浸润等为特征的间质性肺炎病理改变[7]。为观察次代感染动物的病理学改变，在B组的2只婴猴中选取1只于感染后10 d处死，并按以往程序进行相应器官病理学检查[7]。同时，处死1只血液感染对照猴进行同样观察。结果表明，次代感染婴猴中枢神经系统和肺部均出现类似于原代感染婴猴第10天出现的病理改变，其中枢神经系统的病变特点亦为少量神经细胞退行性改变、血管套状炎细胞聚集、灰质细胞明显浸润，并以脑桥和中脑为主要病变区域。同时，肺泡亦出现轻度间质性肺炎表现，小血管周围有炎细胞浸润，肺泡结构和支气管结构也有轻度损伤等。这些病理改变与原代感染婴猴相比程度稍轻，其他组织未见明显改变(表2)。

表2 EV71感染恒河婴猴主要器官的病理改变特征

Tab.2 Pathological changes in EV71-infected neonatal rhesus monkeys

GroupCerebrumCerebellumThalamusMedulla oblongataMidbrainPonsSpinal cordHeartLungTracheaLiverPancreasSpleenA+---+++-++---B---+++++-+----Control----+++-E----

Note: Central nervous system (CNS) lesions were scored according to the evaluation of extent of pathological change in CNS. E, edema and/or hemorrhage; +, cellular infiltration; ++, cellular infiltration with minimal neural damage and tissue damage; +++, cellular infiltration with extensive neural damage and severe damage of tissue; -, no obvious pathological change.

3 讨论

在病毒感染的生物学研究中，动物模型不仅应能反映病原体感染所产生的临床表现、病理学反应及其相应生理学指标改变，还应能反映感染个体是否具有向其他个体传播该病原体的可能[14]，这对病原体感染的动物模型研究提出了更具体的要求。因此，在恒河婴猴的EV71感染研究中，我们同时关注感染后婴猴是否可继续传播及通过何种途径传播病原体的可能。当次代个体通过呼吸道气雾形式接受来自原代感染个体的粪便提取上清液后，可观察到典型的病毒血症；血中病毒检出时间4～9 d，同时出现肢体及口腔黏膜的疱疹性病变、体温升高等一系列类似手足口病的临床症状。进一步观察咽拭子及粪便病毒载量发现，两者的峰值均在血液病毒高峰之后，且在中和抗体效价检测和组织病理学检查中均有类似的表现。这些结果在一定程度上表明，EV71感染的婴猴个体可通过粪便-呼吸道途径继续感染新的易感个体，意味着恒河婴猴作为EV71的感染动物模型可行。本研究证实，病毒不仅能在动物体内完成一个感染的病理过程，还能通过该动物的粪便继续以同样途径感染新的易感个体。同时，本文也进一步证实我们在前期动物实验中观察到的EV71通过呼吸道途径比消化道途径引起更有效感染的现象[7,15]。结合对EV71感染人群进行流行病学观察时所明确发现的感染能在很短时间内波及较大范围内易感者的事实[16]，我们有理由推论，EV71在易感人群中的主要传播途径是呼吸道。当然，其最终证实尚需更多实验及观察。 另外，本研究还观察到，虽然没有直接给予感染，但仅接触次代感染婴猴的哺乳期母猴在血、咽拭子、粪便中均有一过性的病毒排出峰值，病毒载量明显低于原代和次代感染组。这一现象提示，哺乳期母猴因接触次代感染婴猴而导致病毒感染，其后期特异性中和抗体的出现也证明该感染的发生。尽管这些哺乳期母猴并未表现出明显的临床症状，但我们前期针对恒河成年猴的感染性实验结果显示，不同途径感染的所有动物，无论是否具有靶器官的病理改变及明显的病毒血症，均无明显临床表现[17]，与本文中这一现象相符。同时，这一现象从动物模型研究角度支持先前有关感染儿童的EV71可能源自无症状成年感染者的报道[18]。如果这一推论是合理的，则提示一种可能，即人类低龄个体和成年个体对EV71同样敏感，而婴幼儿成为发病主体是因为病毒与婴幼儿发育尚不成熟的免疫系统相互作用，引起机体相应病理损伤。因此，要进一步阐明EV71在儿童群体中的发病规律，还应同时深入探索EV71在婴幼儿体内的具体致病机制。

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