朱凌燕，仇超，徐建青1,,4

1. 上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心，上海 201508； 2. 温州医学院，温州 325035； 3. 复旦大学生物医学研究院，上海 201508； 4. 复旦大学上海医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海 200032

微小RNA(microRNA，miRNA)为一类长度21～24个核苷酸(nucleotide，nt)、内源性的非编码RNA分子。它们能识别靶mRNA上特异性的结合位点﹝通常位于3′非翻译区(untranslated region，UTR)﹞，并通过不完全的碱基配对与靶mRNA结合，引起靶mRNA降解或抑制其翻译，从而对基因进行转录后表达的调控[1,2]。miRNA具有广泛的生物学功能，参与组织分化，细胞发育、凋亡，肿瘤形成等过程的调节[3]。有研究显示，人体中大约92%的基因可能受miRNA调控[2]，miRNA在免疫系统中的功能受到广泛重视。已有研究表明，miRNA在免疫系统的发育和免疫应答中起着重要的作用，不仅调节适应性免疫应答的中心元件，而且参与固有免疫反应[4]。不同于传统的转录因子全开或全关的调节方式，miRNA通过非常短的作用位点进行调节，在作用位点调节1个或少数几个碱基对就能起关键作用，因而miRNA更适合对免疫系统进行精细调节和定量调节[5]。miRNA在宿主对病毒的免疫反应、病毒的免疫逃逸等过程中发挥着重要作用，其与人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)的相互作用过程很好地体现了这一点。

1 宿主基因编码的miRNA

miRNA在病毒与宿主相互作用过程中发挥着重要作用。最近研究表明，宿主miRNA可抑制或促进病毒复制[6]。当病毒侵入宿主后，宿主细胞表达一系列miRNA，形成自身防御体系。由于miRNA介导的RNA静默不需要序列的完全互补，通常miRNA 5′端的2～8个碱基与mRNA的3′UTR互补配对即可[7]，所以1条miRNA可将多种mRNA作为靶位。因此，我们不难想象，在宿主miRNA抑制HIV表达的同时，病毒也会寻求一种方式来调节宿主miRNA的表达，以利于自身的复制。

1.1 宿主miRNA抑制HIV表达

Drosha和Dicer是miRNA成熟所必需的RNA酶。Triboulet等[8]利用小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)下调Drosha和Dicer的表达，发现HIV-1在外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中的复制能力增强，表明宿主miRNA可抑制HIV-1复制。进一步研究发现，miR-17/92的表达量在感染HIV-1的Jurkat细胞中下调，这可能是病毒主动对抗miRNA对其复制抑制的结果。miRNA-17/92是一个多顺反子miRNA簇，编码miRNA-17-(5p/3p)、miRNA-18、miRNA-19a、miRNA-19b-1、miRNA-20a和miRNA-92-1。通过序列分析，并未在病毒基因组中发现miRNA-17/92的结合靶位，但在P300/CBP相关因子(P300/CBP-associated factor，PCAF，一种组蛋白乙酰基转移酶)中存在miRNA-17-5p和miRNA-20的结合位点。PCAF是Tat蛋白的辅助因子，对HIV-1基因表达有重要意义。过表达miRNA-17-5p或miRNA-20能很好地抑制HIV-1复制，抑制miRNA-17-5p或miRNA-20表达能增加PCAF表达量和病毒产生，说明miRNA-17-5p和miRNA-20是通过下调PCAF表达量来抑制病毒复制的。

与miRNA-17/92相似，miRNA-198也是通过作用于细胞周期蛋白T1，间接抑制HIV-1复制[9]。细胞周期蛋白T1是RNA聚合酶Ⅱ的延伸因子——正性转录延伸因子b(positive transcription elongation factor b， P-TEFb，真核转录延伸因子)的调节亚基，也是Tat调节HIV-1 长末端重复序列(long terminal repeat，LTR)所必需的。在人的单核细胞中细胞周期蛋白T1 低表达，但是当细胞分化成巨噬细胞后表达量显著升高。与之相对应，在单核细胞中HIV-1的复制受抑制，而随着细胞周期蛋白T1在巨噬细胞中表达量上升，HIV-1也能自由复制。值得注意的是，尽管细胞周期蛋白T1在单核细胞中的表达量很低，但其mRNA水平并不低，这意味着细胞周期蛋白T1是在mRNA水平受抑制的[10,11]。Sung等[9]对miRNA从单核细胞分化为巨噬细胞过程中表达量的变化进行了分析，并对表达量明显下调的miRNA进行靶位预测，发现包括miRNA-198在内的3条miRNA在细胞周期蛋白T1的3′UTR有结合位点。将这些miRNA的前体转入293T细胞，发现转入miRNA-198前体的293T细胞中细胞周期蛋白T1表达量下降，而mRNA水平未发生改变，说明细胞周期蛋白T1的3′UTR可能是miRNA-198的靶序列。将该蛋白的3′UTR分割成相互有重叠的4段(U3-1、U3-2、U3-3和U3-4)，分别连接至pGL3载体，其中U3-1和U3-4表达受抑制，从而证实了该推测[9]。在单核细胞中抑制miRNA-198表达，细胞周期蛋白T1表达量上升，而过表达miRNA-198能抑制单核细胞分化为巨噬细胞时细胞周期蛋白T1的表达。同时，过表达miRNA-198将抑制HIV-1前病毒的表达以及HIV-1的复制[9]。因此，miRNA-198通过抑制细胞周期蛋白T1的表达行使其抑制HIV-1复制的功能。

不同于上述miRNA间接的作用方式，一些miRNA能直接以HIV-1转录本为靶位。Hariharan等[7]同时运用4种预测软件对miRNA在HIV基因组中的靶位进行预测，发现5个宿主miRNA在HIV基因组中存在靶位(表1)，其中miRNA-29a和miRNA-29b的序列很相似，它们很可能与HIV-1的nef区结合，而结合位点的序列在HIV-1不同亚型(A、B、C、D、F和H)中都是保守的。随后他们通过引物延伸方法检测miRNA-29a、miRNA-29b和miRNA-29c在不同细胞系中的表达，发现在HeLa细胞、PBMC中均有这些miRNA的表达，且表达水平相当[3]。将nef靶区插入荧光素酶的3′UTR，转入HeLa细胞后发现荧光素酶活性下降了3倍左右，而荧光素酶RNA的含量并未发生改变，说明是在转录后水平发生的抑制。用反义寡核苷酸抑制miRNA-29a、miRNA-29b的表达，荧光素酶的活性获得部分恢复，抑制miRNA-29a产生的作用更大些。过表达miRNA-29a能抑制Nef蛋白表达和HIV-1复制。最近研究发现，HIV-1感染者的T细胞存在高丰度的miRNA-29a，与未感染HIV-1 的 293T细胞相比，感染细胞中miRNA-29a表达量提高20%。抑制miRNA-29a可增加HIV-1的产量和感染力；反之，表达miRNA-29a的类似物则抑制病毒复制[12]，这与Hariharan等的结论相符。miRNA在行使功能时与RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)结合，并在细胞质处理小体(cytoplasmic processing body，又称P小体)聚集。为观察miRNA-29a在HIV-1 mRNA与RISC、P小体相互作用中的功能，Nathans等[12]将miRNA-29a野生型和突变体转染293T细胞，发现转染野生型miRNA-29a的细胞中与Ago2(RISC重要组分)、RCK/p54(P小体重要组分)结合的HIV-1 gag mRNA的量均显著高于转染miRNA-29a突变体的细胞，说明miRNA-29a增强HIV-1 mRNA与RISC以及P小体的结合能力。同时，如果消耗P小体的结构蛋白会破坏P小体结构，并导致病毒产量和感染力的增加。

表1 宿主与病毒表达的miRNA的靶位(功能)

Tab.1 Targets (functions) of cellular miRNAs and virus-encoded miRNAs

miRNATarget (function)ReferencesCellular miRNAshsa-miRNA-17/92Downregulate PCAF, inhibit HIV-1 replication[8]hsa-miRNA-198Repress cyclin T1, inhibit HIV-1 expression and replication[9]hsa-miRNA-29a, bRepress Nef, inhibit HIV-1 replication[3,7]hsa-miRNA-149Vpr (predicted))[7]hsa-miRNA-378EnV (predicted))[7]hsa-miRNA-324-5pVif (predicted)[7]hsa-miRNA-28, 125b, 150, 223, 382Repress almost all HIV-1 encoded proteins, including Tat and Rev; involved in HIV latency[14,15]hsa-miRNA-155, 16, 181a, etc.Involved in the development and function of immune system[4]Virus-encoded miRNAsVmiRNA#1-5Proteins involved in signal transduction, protein synthesis, and degradation, DNA interference, etc.(predicted)[19]miRNA-TAR-3p, 5pHDAC-1-mediated repression of HIV expression; down-regu-late apoptotic genes, especially ERCC1 and IER3[18,21]HAA-miRNADownregulate IL-15, IL-2 receptor γ chain, IRAK1, and FM-RP (predicted)[26]HIV-1-miRNA-H1Induce knockdown of AATF; suppress genes encoding for Bcl-2, c-Myc, Par-4 and Dicer; downregulate miRNA-149[27]miRNA-N367HIV-1 promoter interference [29]miRNA-TAR2-3p, 5pNot verified[24]

HIV-1在静息CD4+T细胞中潜伏是现有抗病毒药物清除HIV-1的主要障碍，因为现有药物只能作用于复制中的病毒[13]。因此，深入理解HIV-1如何维持潜伏对研发清除病毒库的策略具有极为重要的意义。Huang等[14]发现，一些宿主miRNA与HIV-1的潜伏相关。将来自不同HIV-1毒株(NL-43、89.6、JR-CS、LAI.2和YU.2)的3′UTR插入pEGFP-C1载体上增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因的3′UTR，发现带有HIV-1 3′UTR的荧光强度低于空载体对照组，说明插入的片段很可能包含miRNA的作用靶位，且该靶位在不同毒株保守存在。将HIV-1 NL4-3序列 3′端1.9 kb片段切成6小段(A～F)，分别连接到pEGFP-C1载体，并转染静息CD4+T细胞，其中与B、D和F片段连接的EGFP表达量显著下降，因此miRNA的结合位点可能就在这3个片段上。对B、D和F片段进一步分割至每个片段长40～76 nt，精确定位miRNA可能的结合位点。结合静息CD4+T细胞和活化CD4+T细胞中miRNA芯片表达情况及miRNA结合位点的预测结果，发现miRNA-28、miRNA-125b、miRNA-150、miRNA-223和miRNA-382在静息CD4+T细胞中表达量较高，且在B、D和F片段上有结合位点。用miRNA抑制剂抑制这5条miRNA的表达，结果无论是在转染HIV-1克隆的静息CD4+T细胞，还是在感染者来源的静息CD4+T细胞中，HIV-1蛋白的表达量和病毒产量都增加。说明miRNA-28、miRNA-125b、miRNA-150、miRNA-223和miRNA-382能抑制静息CD4+T细胞中HIV-1的复制，因而与HIV的潜伏有关。最近有研究表明，在新分离的PBMC中，抗HIV-1 miRNA(miRNA-28、miRNA-150、miRNA-223和miRNA-382)水平显著高于单核细胞衍生的巨噬细胞。抑制这些miRNA在单核细胞中的表达可提高HIV-1的感染力，增加在巨噬细胞中的表达则抑制HIV-1的复制[15]，表明这些miRNA介导的固有免疫在保护单核-巨噬细胞免受HIV-1感染中发挥重要作用。

1.2 HIV感染导致宿主miRNA表达异常

在宿主miRNA抑制HIV表达和复制的同时，HIV采取某些方式主动抑制这些miRNA(如miRNA-17/92)。此外，HIV诱导某些抑制细胞基因miRNA的表达以利于自身存活。将转染pNL4-3的HeLa细胞和对照一起进行miRNA芯片检测，发现与未表达HIV的细胞相比，表达HIV的HeLa细胞中大多数miRNA是下调的，上调的miRNA极少见[6]。对感染HIV和未感染HIV的Jurkat细胞进行基因芯片分析，发现包括miRNA-122、miRNA-370、miRNA-373﹡和miRNA-297在内的11个miRNA上调，其中一半miRNA只在感染细胞中检测到[8]。对HIV感染者和正常人PBMC中的miRNA进行基因芯片分析，发现miRNA-329、miRNA-126﹡和miRNA-424是上调的[16]。尽管还没有这些上调的miRNA功能的相关报道，但它们很可能是HIV诱导的，并可能有利于增强HIV的复制能力、感染性或存活等，当然也不排除这些miRNA的上调是宿主主动抵抗HIV感染的结果。最近对HIV脑炎(HIV encephalitis，HIVE)的研究表明，Tat能够解除特定miRNA的表达抑制，包括存在于主要皮质神经元的miRNA-128，而miRNA-128a能抑制突触相关蛋白25 (synaptosomal-associated protein 25，SNAP25)的表达[17]。SNAP25作为可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(solubleN-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor， SNARE)的组分之一，在突触囊泡与质膜融合、触发神经递质释放过程中起重要作用[18]。HIVE是HIV-1感染的临床表现，可引起神经元损伤和功能紊乱。由于神经元很稀少，一旦感染HIV-1后，将接触到细胞毒素、细胞因子及Tat等。用重组体Tat1-72处理E17大鼠的胚胎皮质神经元后进行基因芯片检测，发现6个miRNA(miRNA-374、miRNA-128a、miRNA-128b、miRNA-100、miRNA-25和 miRNA-99a)上调，其中miRNA-100、miRNA-128a和miRNA-374上调的表达量被重复验证，说明这些由Tat上调的miRNA极有可能与疾病进程有关。

2 HIV编码的miRNA

HIV-1被证实能抵抗治疗、逃避免疫应答、改变细胞免疫功能和避免感染细胞凋亡。病毒必须用其仅表达9个蛋白的有限基因组来完成这些功能，因此除需大量利用细胞途径并破坏原有分子加工过程外，病毒自身基因组的miRNA也是一个操纵细胞功能的强有力工具[19]。

2.1 HIV miRNA作用于宿主细胞

Bennasser等[20]运用计算机预测，HIV-1可能编码5个pre-miRNA，推测理论上能形成10条成熟的miRNA(VmiRNA#1～5)。将这些预测的miRNA序列与人基因组3′UTR序列数据库进行比对，发现大量细胞mRNA是这些miRNA的靶位点。这些预测的靶位点与编码蛋白激酶、离子通道、参与蛋白质合成与降解的蛋白质、生长因子以及DNA甲基化等的细胞基因有关。值得注意的是，VmiRNA#1和VmiRNA#5分别与随后研究发现的2条反式激活应答(transactivation response，TAR)元件来源的miRNA重叠或部分重叠，意味着其他几条预测的VmiRNA可能也存在并参与对病毒或宿主基因的调控。

TAR为长59 nt的茎-环结构，位于HIV-1转录产物5′LTR的R区，能被Tat、P-TEFb识别和结合，以增加病毒基因的转录[2]。TAR RNA结合蛋白(transactivation response RNA binding protein，TRBP)是Dicer所必需的辅助蛋白，也是RISC的重要组成部分，而TAR可通过消耗TRBP而使下游的Dicer-RISC复合体缺少TRBP[21]。这可能部分解释了为何HIV-1感染的细胞中miRNA表达量大多是下调的。TAR除通过结合TRBP调节宿主miRNA表达外，其自身也能编码miRNA。Klase等[22]检测到CD4+T细胞系表达Dicer，在体外条件下中观察到Dicer能结合TAR并将其裂解，形成TAR来源的miRNA。这种miRNA存在于感染HIV-1的细胞系以及感染者来源的T细胞中，能引起组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1，HDAC-1)与病毒LTR结合，削弱病毒基因的表达，说明此病毒miRNA可能参与维持病毒的潜伏。随后，Ouellet等[23]用RNA印迹、引物延伸和RNase保护实验证明了2个TAR来源的miRNA，并将源于TAR茎左臂的miRNA命名为miRNA-TAR-5p，将源于右臂的命名为miRNA-TAR-3p，后者似乎优先在HIV阳性细胞中聚积。有学者推测，在HIV-2也存在TAR来源的miRNA：miRNA-TAR2-5P和miRNA-TAR2-3P。已有研究发现了124 nt的TAR2 RNA结构域，其很可能编码miRNA前体。至于miRNA-TAR2的表达则有待确认[24]。最近研究发现，TAR miRNA的表达能使细胞免于凋亡，并且下调参与细胞凋亡的基因，尤其是ERCC1和IER3，TAR miRNA在调节蛋白表达时不影响mRNA水平[19]。由于TAR miRNA在病毒生活史各个阶段均有表达，也可在潜伏感染细胞中检测到[22]，所以TAR miRNA可通过延长感染细胞的存活时间以增加病毒的复制。

HIV反义起始启动子(HIV antisense initiator，HIVaINR)元件来源于HIV-1 LTR区的TAR DNA，其自身能编码蛋白。同时由于其反转录产物与所有HIV RNA转录物起始的约25个nt重叠，预示其具有调节自身基因表达的巨大潜能[25,26]。Ludwig等[26]运用M-折叠法分析HIVaINR，发现这种反义RNA能形成多种多样的茎-环或发夹样二级结构，这些二级结构可能是被命名为HAA-miRNA的病毒的miRNA(VmiRNA)前体。通过预测发现，白细胞介素15(interleukin-15，IL-15)、IL-2受体γ链、人脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein，FMRP)和IL-1受体辅助激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase 1， IRAK1)是HAA-miRNA的靶位[27]。其中IL-15对T细胞的成熟、自然杀伤(natural killer，NK)细胞的发育和存活及长期记忆细胞的存活有重要意义；IL-2受体γ链是IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21受体的共性元件，该受体的异常表达导致严重的T细胞和NK细胞缺陷；IRAK1是天然免疫的一个决定性信号传递介质[25]。因此，HAA-miRNA对IL-15、IL-2受体γ链、FMRP和IRAK1表达量的下调将对免疫系统造成损伤，并且有利于病毒在宿主中存活。FMRP是一种RNA结合蛋白，参与蛋白质合成和miRNA加工。HIV可利用HAA-miRNA耗尽FMRP以解除宿主处理病毒的miRNA机制[27]。尽管尚未证实这些HAA-miRNA的存在，但可以推测它与其他病毒一样，有利于HIV存活。与TAR来源的miRNA不同，Kaul等[28]研究发现，HIV-1-miRNA-H1能诱导拮抗凋亡转录因子(apoptosis antagonizing transcription factor，AATF)基因下调约80%，导致编码抑制凋亡的bcl-2基因和增殖相关的c-myc基因受抑制。由于AATF可通过Dicer基因启动子区的E2F(高等真核生物的转录因子)调节Dicer的表达，因此AATF下调导致Dicer表达量下降。同时，HIV-1-miRNA-H1还能下调以HIV-1编码的Vpr为靶位的细胞miRNA-149，并最终启动人单核细胞的凋亡。

2.2 HIV miRNA作用于病毒本身

HIV-1的nef基因位于病毒基因组的3′端，并与3′ LTR部分重叠，它在病毒复制初始阶段高表达。Nef是一个多功能辅助蛋白，在病毒复制中起重要作用。同时由于Nef能下调CD4、CD8以及主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类分子[25]，因此在发病机制方面起关键作用。几个相关研究发现，nefRNA可能是一种调节HIV-1复制的顺式调控因子，某些Nef变异体可抑制HIV-1复制[29-31]。Omoto等[32]通过研究来自持续感染HIV-1 ⅢB的MT-4 T细胞RNA发现，miRNA-N367可能是nef来源的抑制HIV-1复制的miRNA。miRNA-N367是一条来源于nef区的miRNA，在体外实验中能阻断HIV-1nef表达，在人和15-2-2 模型小鼠体内也能抑制nef表达。与传统的miRNA作用方式不同，miRNA-N367并不在转录后水平影响基因表达，而是通过干扰启动子在转录水平起作用。将pH1-miRNA-N367、pCD-Tat以及含有HIV-1 LTR全长的Luc质粒(pLTRSF2)或U3区负向反应元件(negative responsive element，NRE)缺失的Luc质粒(pLTRSF2-105)转染Jurkat细胞，48 h后检测Luc荧光强度，发现在miRNA-N367的作用下含有NRE的pLTRSF2质粒转录活性下降约40%，而NRE缺失的pLTRSF2-105质粒转录活性没有显著变化。在pHILL质粒的Luc基因下游插入nef基因﹝pHILL(+)﹞，或反向插入nef作为阴性对照﹝pHILL(-)﹞。在不表达miRNA-N367的情况下，与转染pLTRSF2的细胞相比，转染pHILL(+)的细胞内Luc活性降低约60%；在表达miRNA-N367的情况下，降低约80%。而转染pHILL(-)的细胞内Luc活性没有显著改变。说明miRNA-N367通过5′LTR区的NRE和3′UTR区的nef序列抑制HIV-1启动子的活性[33]。尽管miRNA-N367起作用的精确机制有待研究，但可以推测miRNA-N367能抑制HIV-1复制，并允许持续低致病性或潜伏病毒感染。由于nef基因在HIV-2中保守存在，因此HIV-2可能通过同样的机制在宿主中保持低调。

3 结语

HIV-1是慢病毒的一个亚类，能感染分裂和不分裂的细胞，在病毒RNA基因组反转录后整合到宿主染色体中。若不产生病毒颗粒则进入潜伏阶段，此时病毒仍然存在于静息的CD4 T细胞中，躲避宿主免疫监督和抗病毒药物治疗。当静息细胞被激活，就能产生感染性的病毒颗粒。许多控制HIV潜伏的因子仍未知，而现有的大部分治疗方案无法清除细胞内潜伏病毒储存库。完全互补的反义miRNA抑制剂能阻断miRNA的抑制效应，并且在不激活细胞的情况下驱使病毒产生[34,35]，这对接受高效抗反转录病毒治疗(highly active anti-retroviral therapy，HAART)的个体具有重要意义。然而，宿主miRNA与HIV的相互作用是复杂的：宿主miRNA可抑制HIV表达(如miRNA-17/92、miRNA-198和miRNA-29a等)，HIV感染也可导致宿主miRNA异常表达(如miRNA-122、miRNA-370和miRNA-128等)。不同miRNA调节的方式也不尽相同：以成簇或单独或三聚体形式间接或直接作用于病毒[8,12,36]。病毒miRNA的存在及最近研究发现的HIV-miRNA-H1的可演化性[37]更增加了整个调控网络的复杂性。因此，有必要深入研究miRNA在HIV生活史中的作用及其机制，这不仅有助于鉴定调节HIV表达的新靶标，而且有助于建立有效的miRNA新疗法。

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