陈 伟，黄广民*

(海南大学食品学院，海南 海口 570228)

酶法水解香/芭蕉根部球茎粉浆研究及动力学分析

陈 伟，黄广民*

(海南大学食品学院，海南 海口 570228)

考察香/芭蕉根部球茎粉浆酶法水解液化过程，采用液态高温α-淀粉酶，在高温条件下作用于香/芭蕉根部球茎粉浆，通过单因素和正交试验，分别检测水解液中还原糖含量，以考察其作用情况。结果表明：液化温度85℃、粉浆pH6.4、香/芭蕉根部球茎粉浆质量浓度30mg/mL、加酶量0.064mL/g，酶法水解液化效果最佳，Vm为0.708mg/(mL·min)，Km为27.410mg/mL，水解液的DE值达到37.61%。

香/芭蕉根部球茎；高温α-淀粉酶；动力学

香/芭蕉是生物量极大的植物，其茎秆包括根部球茎和假茎秆两部分。球茎俗称香/芭蕉头，是着生根系、叶片和吸芽的部位，是整个植株养分产生和贮藏的部位，供根系、叶片、吸芽、花果的生长和发育。据估计每亩产鲜茎秆≥40吨。其中鲜根部球茎≥15吨；鲜假茎秆≥25吨，每亩产茎秆干物质≥4吨，其中根部球茎干物质≥1.5吨。然而香蕉收获后，人们常将香蕉根部球茎全部挖除更新，重新种植来年才有好的收成[1]。若能充分利用这一废弃资源生产燃料乙醇，变废为宝，必将对减少环境污染、改善生态环境、实现低碳经济具有重要意义，并为香/芭蕉重复种植和根除病源病害、大幅度提高香/芭蕉产量和品质、增加农民收入、提高蕉园利用率，促进高效农业的发展提供一定参考。

经初步分析，香/芭蕉根部球茎含有丰富的果胶质、淀粉质、杂多糖、半纤维素和纤维素等碳水化合物，其水解后，水解液含有葡萄糖、甘露糖、果糖等糖类，可用于发酵制备燃料乙醇。其水解方法有酸水解法、酶水解法、酶和酸混合水解法，水解方法和水解的工艺条件直接关系到燃料乙醇产率，关系到该原料的有效利用率。

液态高温α-淀粉酶是一种新型液化型酶制剂，具有优越的热稳定性，在果葡糖浆和酒精的生产中，它可使粮食淀粉糊化和液化同时进行，大大简化和缩短工艺过程。香/芭蕉根部球茎具有不同于粮食淀粉的组织结构，液态高温α-淀粉酶能否在高温下水解和液化香/芭蕉根部球茎粉浆，使其转化为低聚糖和单糖等可发酵物质，是该原料生产燃料乙醇亟待解决的重要问题[2-4]。利用液态高温α-淀粉酶，酶解液化香/芭蕉根部球茎粉浆的研究，尚未见文献报道，因此本研究旨在探讨使香/芭蕉根部球茎粉浆一步液化和糖化、缩短燃料乙醇制备的工艺过程。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香/芭蕉根部球茎干粉的制备：新鲜的香/芭蕉根部球茎，切片，烘干，粉碎，过筛至80～100目，控制水分含量小于10%，备用。

盐酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、3,5-二硝基水杨酸(DNS)、葡萄糖等试剂均为分析纯及以上纯级；液态高温α-淀粉酶(3000U/mL) 山东枣庄市杰诺生物酶有限公司。

1.2 仪器与设备

721-型分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；280-型齿爪式粉碎机 广州广莱农业机械设备有限公司；601BS-型恒温水浴锅 江苏省金坛市晨阳电子仪器厂。

1.3 香/芭蕉根部球茎粉浆酶水解液中还原糖测定方法的建立

为准确、方便、快捷地跟踪检测液态高温α-淀粉酶在高温下作用于香/芭蕉根部球茎粉浆水解液中还原糖含量的变化，有必要建立一套适合于本工艺要求的还原糖测定方法。本实验以葡萄糖为标准，用3,5-二硝基水杨酸(DNS)为显色剂，采用分光光度法测定酶水解液中还原糖的含量[5-7]，其测定方法简述如下：

称取经干燥后的葡萄糖0.1000g，加适量蒸馏水溶解，转入100mL容量瓶，加蒸馏水稀释定容，配制成质量浓度1.0mg/mL的标准葡萄糖溶液。在0～10.0mL范围内，按1.0mL增序，分别准确吸取一定量的葡萄糖标准溶液于25mL容量瓶，加入2.0mL DNS溶液，2.0mL蒸馏水，使葡萄糖质量浓度分别为0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.36、0.40mg/mL，于100℃水浴中加热5min，迅速冷却，加蒸馏水稀释定容。选择1cm比色皿，在490nm波长处测定吸光度，同时做空白实验。以葡萄糖质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线(图1)。并得回归方程为y=1.140x－ 0.042(R2=0.999)。

图1 葡萄糖含量测定标准曲线Fig.1 Standard curve for glucose determination

1.4 香/芭蕉根部球茎粉浆水解液还原糖含量测定

精确称量5.000g香/芭蕉根部球茎干粉于三颈烧瓶中，加入一定pH值的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液调成浆状，装上回流冷凝管，加入液态高温α-淀粉酶，控制粉浆总体积为100mL，以不同的水解温度、不同的香/芭蕉根部球茎粉浆质量浓度、不同的水解时间进行水解实验。分别按酶解20min的时间增序，取0.5g样液于25mL容量瓶，加蒸馏水稀释定容，分别吸取2.0mL水解稀释液于50mL容量瓶，加入2.0mL DNS显色剂，于100℃水浴中加热5min显色，迅速冷却，用蒸馏水稀释定容。选用1cm比色皿，在490nm波长处，测定香/芭蕉根部球茎粉浆酶水解液的吸光度，按标准回归曲线计算还原糖含量，以DE值表示。

2 结果与分析

2.1 液态高温α-淀粉酶反应条件的分析

2.1.1 粉浆酸度对香/芭蕉根部球茎粉浆中多糖水解的影响

分别称取香/芭蕉根部球茎干粉5.000g，加入一定体积pH值为4.0、4.4、5.0、5.4、6.0、6.4、7.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，控制香/芭蕉根部球茎粉浆质量浓度为50mg/mL，加入液态高温α-淀粉酶的量为0.064mL/g，于80℃恒温水解，按1.4节方法检测水解液中还原糖含量，考察粉浆酸度对香/芭蕉根部球茎粉浆中的多糖水解的影响，结果如图2所示。

图2 粉浆酸度对香/芭蕉根部球茎粉浆水解的影响Fig.2 Effect of pH of added citric acid/disodium hydrogen phosphate buffer on DE

由图2可见，粉浆pH＜6.0时，随着酸度的增大，液态高温α-淀粉酶的活性很小，香/芭蕉根部球茎粉浆中的多糖几乎没被酶水解，水解液中还原糖含量很小；当粉浆pH＞6.0时，香/芭蕉根部球茎粉浆中的多糖酶解量随酸度的增大而增大，水解液中还原糖含量呈急剧增大，且当粉浆pH6.4时达到最大值。此后，随着粉浆酸度增大，香/芭蕉根部球茎粉浆酶水解液中还原糖含量呈线性下降。因此，香/芭蕉根部球茎粉浆中的多糖酶解液化最佳pH值为6.4。

2.1.2 加入液态高温α-淀粉的量对香蕉根部球茎粉浆中多糖水解的影响

分别称取香/芭蕉根部球茎干粉5.000g，加入一定体积pH6.4柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲溶液，控制香/芭蕉根部球茎粉浆质量浓度为50mg/mL，水解温度80℃，加入液态高温α-淀粉酶的量分别为0.016、0.032、0.048、0.064、0.096mL/g。按1.4节方法检测水解液中还原糖含量，考察加入液态高温α-淀粉酶的量对香/芭蕉根部球茎粉浆中的多糖水解的影响，其结果如图3所示。

图3 高温α-淀粉酶的添加量对香/芭蕉根部球茎粉浆水解的影响Fig.3 Effect of enzyme loading on DE

由图3可见，加入液态高温α-淀粉酶的量小于0.064mL/g时，随着酶添加量的增加，香/芭蕉根部球茎粉浆水解液中还原糖含量呈线性缓慢增大，当加入液态高温α-淀粉酶的量＞0.064mL/g时，再继续增加酶的量，香/芭蕉根部球茎粉浆水解液中还原糖含量几乎保持不变，其水解液的DE值几乎是一组平行于横坐标的直线，而酶添加量为0.064mL/g，是香/芭蕉根部球茎粉浆中多糖水解曲线的一个拐点。因此，酶添加量应以0.064mL/g为宜。

2.1.3 温度对香/芭蕉根部球茎粉浆中多糖水解的影响

图4 水解温度对香/芭蕉根部球茎粉浆水解的影响Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on DE

分别称取香/芭蕉根部球茎干粉5.000g，加入一定体积pH6.4柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，控制香/芭蕉根部球茎粉浆质量浓度为50mg/mL，为0.064mL/g，分别以65、75、80、85、90℃恒温水解。按1.4节方法检测水解液中还原糖含量，考察粉浆温度对香/芭蕉根部球茎粉浆中的多糖水解的影响，结果见图4。

由图4可见，水解温度＜75℃时，液态高温α-淀粉酶的活性很小，香/芭蕉根部球茎粉浆中的多糖水解的速率缓慢，水解液中还原糖含量很小。当水解温度在75～85℃时，随着水解温度的增大，香/芭蕉根部球茎粉浆中的多糖酶水解速度迅速增加，水解液中还原糖含量(DE值)呈线性急剧增大。当水解温度至85℃时，水解液中还原糖含量达到最大值。当水解温度＞85℃，随着水解温度的增大，香/芭蕉根部球茎粉浆的水解液中还原糖含量呈线性下降。表明液态高温α-淀粉酶在水解温度＞85℃时其活性下降或钝化。因此，液态高温α-淀粉酶作用于香/芭蕉根部球茎粉浆中的多糖，最佳温度应为85℃。

2.1.4 底物质量浓度对香蕉根部球茎粉浆中多糖水解的影响

底物质量浓度[S]指香/芭蕉根部球茎粉浆的质量浓度，它是影响其中的多糖水解的重要因素之一。分别称取一定量的香/芭蕉根部球茎干粉，加入pH6.4柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，底物质量浓度[S]分别控制在10、20、30、40、50、60、80mg/mL，α-淀粉酶量为0.064mL/g，水解温度85℃。按1.4节方法检测水解液中还原糖含量，考察底物质量浓度[S]对香/芭蕉根部球茎中多糖水解的影响，结果见图5。

图5 底物质量浓度对香/芭蕉根部球茎粉浆水解的影响Fig.5 Effect of substrate concentration on DE

由图5可见，香/芭蕉根部球茎粉浆的质量浓度＜20mg/mL时，其水解液中还原糖的含量随底物质量浓度的增大呈线性增大，当底物质量浓度达到20mg/mL时，香/芭蕉根部球茎粉浆水解液中还原糖含量接近达到最大值。香/芭蕉根部球茎粉浆的质量浓度＞30mg/mL时，随着底物质量浓度的增大，水解度呈线性减少。因此，香/芭蕉根部球茎粉浆酶水解时，液态高温α-淀粉酶的量和底物质量浓度的最佳配比为0.31:1，此时水解液中还原糖含量(DE值)可达到37.61%。

2.2 液态高温α-淀粉酶水解香/芭蕉根部球茎粉浆的动力学特性分析

根据酶水解液中还原糖含量和香/芭蕉根部球茎粉浆质量浓度对应的曲线簇，选择较具有代表性的水解时间40min，香/芭蕉根部球茎粉浆中的多糖酶解后，水解液中还原糖含量的曲线，分别计算单位时间内还原糖的生成量，即以还原糖的生成速率随着底物质量浓度的关系作图，其结果如图6所示。可以看出，单位时间内还原糖生成的量(反应速率，v)对底物质量浓度([S])呈典型的双曲线关系，符合经典的表征酶促反应特征的米氏方程所绘制的曲线。

图6 反应速率与香/芭蕉根部球茎粉浆底物质量浓度的关系Fig.6 Relationship between reaction velocity and substrate concentration

分别对还原糖的生成速率和底物质量浓度取对数，以lnv-ln[S]作图，其结果见图7，图7为一条直线，可认为香/芭蕉根部球茎粉浆，加入一定体积pH6.4柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液调成粉浆，加入液态高温α-淀粉酶，在很短的一段时间内，香/芭蕉根部球茎粉浆中的多糖酶解遵循一级反应规律[8]，酶解的速率与香/芭蕉根部球茎粉浆质量浓度的对数关系遵循米氏方程规律，可用米氏方程对实验数据进行拟合。

图 7 lnv与 ln[S]关系图Fig.7 Relationship between lnv and ln[S]

Michaelis-Menten方程提出酶促反应按下列两步进行：

即液态高温α-淀粉酶(E)与香/芭蕉根部球茎粉浆中的多糖(S)首先结合成中间酶合产物(ES)，中间酶合产物分解生成产物还原糖(P)后，使液态高温α-淀粉酶重新游离出来[9]。式中k1为酶合中间产物ES生成的反应速率常数，k2和k3分别代表中间酶合产物ES分解为E+S和E+P的反应速率常数，k4为E+P复合生成ES的反应速率常数。反应初期，没有还原糖产物(P)或还原糖产物质量浓度[P]很低，k4可忽略不计，故第二步反应可认为是单向的。由质量守恒定律可得到反应动力学模型：

米氏常数Km和最大反应速率Vm是香/芭蕉根部球茎粉浆中的多糖酶促反应中两个重要动力学参数。Km=(k2+k3)/k1，相当于酶的活性部位一半被香/芭蕉根部球茎粉浆中的多糖占据时所需的底物质量浓度；Vm=k3[Et]，表示高温α-淀粉酶质量浓度不变时，酶被底物饱和，反应速度达到最大。

2.2.1 用Lineweaver-Buck (双倒数做图法)求解米氏常数和最大反应速率

米氏常数Km和最大速率常数Vm，通常用米氏方程转型后的Lineweaver-Buck求解[10]，将上式倒数后得如下方程：

式中的斜率=Km/Vm，纵截距=1/Vm。以1/v对1/[S]作图，得到图8所示的各对应点，再用最小二乘法线性拟合，可得到直线方程1/v=39.519/[S]+1.373，即液态高温α-淀粉酶水解香/芭蕉根部球茎粉浆中的多糖的米氏常数Vm=0.728mg/(mL·min)，Km=28.777mg/mL。米氏方程为：

方程的相关系数R=0.979，方程相关性显著。

图8 高温α-淀粉酶水解香/芭蕉根部球茎粉浆的Lineweaver-Buck图Fig.8 Lineweaver-Buck plot of thermostable alpha-amylase-catalyzed hydrolysis of banana corm powder

2.2.2 用Wilkinson统计法求解米氏常数和最大反应速率

Wilkinson统计法包括非线性二乘法求估算解和泰勒展开式求精校解[11]，计算过程分两步，如表1、2所示。

式中：Vm0为最大反应速率的估算解；Km0为米氏常数的估算解。

式中：b1、b2为Vm和Km计算过程中修正常数。

由此可求得精较解：

表1 WiIkinson法求估算解Table 1 Estimated resolution of Vm and Km by Wilkinson method

表2 Wilkinson 法求精校解Table 2 Accurate resolution of Vm and Km by Wilkinson method

2.2.3 Lineweaver-Buck法和Wilkinson 统计法的比较

表3 Lineweaver与 Wilkinson求解结果比较Table 3 Comparisons on Vm and Km obtained by Lineweaver and Wilkinson methods

由表3可以看出，Lineweaver-Buck法和Wilkinson统计法处理得到的Vm和Km值有一定的差别。其原因是用Lineweaver-Burk法作图[12]，香/芭蕉根部球茎粉浆质量浓度[S]应在0.330～2.000Km时求解才准确，而香/芭蕉根部球茎粉浆浓度很低时，酶解速率很低，取倒数后，其对应的点偏离拟合曲线较远，将影响动力学参数Km和Vm的准确测定，即使采用最小二乘法进行线性回归分析，也难于有效地消除它的影响。然而尽管如此，此法仍广为采用。Wilkinson统计法被认为是计算结果较为可靠的方法，但计算过程冗长而复杂。分析比较后，本实验采用Wilkinson统计法的求解结果[13-16]，即Vm为0.708mg/(mL·min)，Km为27.410mg/mL。

2.3 香/芭蕉根部球茎粉浆酶解条件优化

根据液态高温α-淀粉酶作用于香/芭蕉根部球茎粉浆中的多糖的反应条件及影响因素，下述选择A(温度)、B(pH值)、C(底物质量浓度)、D(加酶量)，以L9(34)正交表进行试验，各组按照表中不同的条件水解40min，取0.5g样液于25mL容量瓶，按1.4节方法测定水解液中还原糖含量，并以此作为考察香/芭蕉根部球茎粉浆中的多糖酶解液化和糖化效果的指标，其正交试验设计及结果如表4所示。

表4 正交试验方案及结果Table 4 Orthogonal array design arrangement and experimental results

由表4可知，影响香/芭蕉根部球茎粉浆中的多糖酶解主次因素顺序为A＞B＞C＞D，即温度＞pH值＞底物质量浓度＞酶添加量。若不考虑交互作用，则液态高温α-淀粉酶水解香/芭蕉根部球茎粉浆中的多糖较优条件为A2B2C3D2，即酶解温度85℃、pH6.4、底物质量浓度30mg/mL、酶添加量0.064mL/g。利用较优组合条件进行水解实验，得到水解液中还原糖含量(DE值)为37.61%。

3 结 论

综上所述，利用液态高温α-淀粉酶作用于香/芭蕉根部球茎粉浆，最佳水解工艺条件为粉浆酸度pH6.4、底物质量浓度30mg/mL、酶添加量0.064mL/g、酶解温度85℃。在该工艺条件下，香/芭蕉根部球茎粉浆中的多糖可温和地水解，水解液中还原糖含量最高，DE值可达37.61%。且液态高温α-淀粉酶作用于香蕉根部球茎粉浆中的多糖，其酶解反应遵循一级反应规律，遵循Michaelis-Menten方程，米氏常数Km=27.41mg/mL，最大反应速度Vm=0.708mg/(mL·min)。利用液态高温α-淀粉酶水解香蕉根部球茎粉浆中的多糖，可实现原料的液化和糖化同步进行，简化工艺过程，有利于燃料乙醇的生产，降低生产成本。

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Optimal Conditions and Kinetics of Enzymatic Hydrolysis of Banana Corm Powder

CHEN Wei，HUANG Guang-min*
(College of Food Science and Technology, Hainan University, Haikou 570228, China)

The optimal conditions for the hydrolysis of banana corm powder with thermostable alpha-amylase were investigated by single-factor and orthogonal array design methods, and a kinetic analysis of the hydrolysis of banana corm powder was performed. Liquefaction temperature of 85 ℃, pH of 6.4, substrate concentration of 30 mg/mL and enzyme loading of 0.064 mL/g were found optimal, and a DE value of 37.61% was obtained under these conditions. TheVm andKm were determined to be 0.708 mg/ (mL·min) and 27.410 mg / mL, respectively.

banana root corm; thermostable alpha-amylase; kinetics

S668.1

A

1002-6630(2010)20-0260-06

2010-06-22

海南省教育厅高校科研项目(Hj200710)；海口市重点科技项目(0000017)

陈伟(1985—)，男，硕士研究生，主要从事糖及碳水化合物研究。E-mail：chwhg@sina.com

*通信作者：黄广民(1957—)，男，教授，主要从事糖及碳水化合物和生物质能源研究。E-mail：hgmin886699@163.com