鲍琳琳,孙惠惠,占玲俊,邓 巍,许黎黎,朱 华,徐艳峰,张连峰,秦 川

(中国医学科学院实验动物究所,北京协和医学院比较医学中心,北京 100021)

研究报告

A/California/7/2009与 A/California/4/2009
病毒感染力比较

鲍琳琳,孙惠惠,占玲俊,邓 巍,许黎黎,朱 华,徐艳峰,张连峰,秦 川

(中国医学科学院实验动物究所,北京协和医学院比较医学中心,北京 100021)

目的甲型 H1N1流感病毒A/California/7/2009与A/California/4/2009病毒序列比较同源性在 99%以上,本实验旨在比较两株病毒感染BALB/c小鼠研究感染力强弱。方法分别将 A/California/7/2009(CA7)与A/California/4/2009(CA4)两株病毒分别连续 10倍稀释后,对 4～6周龄雌性BALB/c小鼠经乙醚麻醉后进行滴鼻攻毒,每个稀释度接种 10只实验小鼠,测定 CA7 MLD50为 101.24/0.05 mL,检测小鼠感染、致病的多项指标,观察期为 14 d。结果相同 TC ID50的 CA7和 CA4病毒感染小鼠,CA4感染小鼠后 14 d内死亡率为 20%,而 CA7感染小鼠后 8 d内死亡率为 100%。CA7 106TC ID50感染的小鼠病理表现为重度弥漫性间质性肺炎,CA4 106TC ID50感染的小鼠病理表现为中度-重度间质性肺炎。结论在相同条件下,CA7感染力明显强于 CA4。

A/California/7/2009;A/California/4/2009;H1N1;BALB/c小鼠

当前一些国家发生的人感染猪流感疫情,已成为全球高度关注的公共卫生事件。日前,美国感染猪流感病例 36286人,死亡 189人,亚洲其它地区1934人,中国 414人。世界卫生组织已将这次流感流行的警告级提高到最高级别。面对如此迅速发展的疫情,各国针对 H1N1的科学研究工作也在有条不紊的进行。为研究 H1N1甲型流感病毒的病原特性、致病机理及对其疫苗与救治药物效果评价提供平台,对 A/California/7/2009和 A/California/4/ 2009(简称CA4和CA7)H1N1甲型流感病毒进行了序列分析,比对结果两株病毒同源性在 99%以上。基于两株病毒高度同源的基础进行了病毒感染能力的比较。将两株病毒细胞传代和鸡胚传代,得到相同滴度毒种连续 10倍稀释后[1],对 4～6周龄雌性BALB/c小鼠经乙醚麻醉后进行滴鼻攻毒,每个稀释度接种 10只实验小鼠,测定其MLD50,检测小鼠感染、致病的多项指标,观察期为 14 d[2-7]。比较 2株毒株感染力强弱,建立 H1N1病原实验动物模型,以期为疾病诊断、治疗、疫苗研发等研究提供平台。

1 材料和方法

1.1 材料

H1N1病毒株为 A/California/7/2009和 A/ California/4/2009,其 HA效价都为 1∶32,CA4 106TC ID50/0.2 mL,CA7106TC ID50/0.2 mL。SPF级雌性BALB/c小鼠,4～6周龄(体重 18～20 g),由医科院实验动物研究所提供 [SCXK(京)2004-0001]。犬肾MDCK传代细胞系本所储存细胞,按常规方法传代培养。0.01 mol/L pH 7.2PBS配制成0.1%的豚鼠红细胞悬液,4℃保存。RVC-Ⅱ型独立送风隔离笼具 TENCN IPLAST公司;AMV反转录酶及 RNA酶抑制剂购自 Promega公司;Taq plus DNA聚合酶及 dNTP购自 TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的感染性:实验在本所的BSL-3实验室中进行。将 110只 4～6周龄雄性 BALB/c小鼠随机分为 1个对照组和 10个实验组。每组 10只,每笼 5只。标记后分别称重。病毒液用MEM液 10×连续稀释,标记为 106TC ID50、105TC ID50、104TC ID50、103TC ID50、102TC ID50。将小鼠乙醚吸入麻醉后,通过滴鼻途径接种小鼠,每只小鼠的接种剂量为 50 μL,对照组小鼠经鼻腔滴入等量的生理盐水。独立送风隔离笼具中正常饲养。实验的观察期为 14 d。实验重复 3次,按 Reed-Muench方法计算该病毒对小鼠的MLD50[8]。

1.2.2 临床观察和取样:每日观察记录小鼠的活动状态及临床表现、称量体重。小鼠死亡后立即无菌采集各脏器,置 -20℃保存备用。称量每只死亡小鼠的体重及肺脏湿重,计算其肺指数 (肺脏湿重/小鼠体重)。

1.2.3 死亡小鼠脏器病毒滴度的测定:用 DMEM液按1∶10(M/V)将死亡小鼠脏器研磨成乳剂,5000 r/min离心 10 min,上清液加双抗 (青霉素、链霉素各 1000 IU/mL)4℃过夜,7000 r/min离心 20 min,取上清,-70℃保存。肺组织上清液 10×连续稀释至 10-8,接种于单层培养MDCK细胞的 96孔细胞培养板上,每个稀释度接种 4个重复孔,CO2培养箱中 37℃静止培养,观察记录各孔细胞病变 (CPE)情况,连续观察 2～3 d,脑、肝、脾、肾以对倍稀释。按照 Reed-Muench方法计算感染小鼠脏器病毒的TC ID50。

1.2.4 病理学检查:无菌取濒死小鼠的肺、脑等脏器,用甲醛固定、石蜡包埋、常规 HE染色,光镜下观察其病理变化。

1.2.5 PCR检测:根据中国 CDC公布的 H1N1亚型禽流感病毒核蛋白基因的保守序列设计一对引物:S W-H1 F786:5′-AATAACATTAGAAGCAACTGG -3′;S W-H1 R920:5′-AGGCTGGTG TTTATRGCACC-3′。扩增片段的大小为 134 bp。常规方法提取RNA,并进行反转录。将反转录产物 5μL,加至 25 μL PCR反应体系中,瞬时离心后置 PCR仪进行扩增。扩增条件:35循环,94℃30 s变性,52℃30 s退火,72℃60 s延伸,72℃延伸 7 min。取阳性标准品及 PCR产物各 10μL在 2%的琼脂糖凝胶上电泳约 30 min,观察电泳条带大小并照相。

1.2.6 数据统计方法:小鼠的体重变化用体重百分比表示,即以小鼠当天体重减去其前 1 d体重的差值作分子,以其前 1 d的体重作分母,记录为平均体重变化百分比 ±标准差,数值采用每组的平均数。小鼠的平均存活天数 (MSD)按照公式:MSD=Σ[f (d-1)]/n计算,其中 d为天数,f为第 n天幸存的小鼠数目(第 8天的数目也被计算在内),n为每组的小鼠数目。

2 结果

2.1 CA7和 CA4对小鼠感染性的测定结果

人工感染后第 3天,106TC ID50～104TC ID50组小鼠体重就开始下降,体重严重下降持续 3～4 d的小鼠最终死亡。病毒感染小鼠的病程为 4～7 d。小鼠在感染后第 3～4天开始死亡,感染后症状的严重程度依接种病毒的浓度。对照小鼠未见异常。依据测得的结果,得出该病毒对小鼠的半数致死量MLD50为101.24/0.05 mL(表 1),以及小鼠的存活情况(图 1)。

表 1 小鼠感染 CA4/CA7流感病毒结果Tab.1 Infected result ofmice infected CA7/CA4 virus

图 1 小鼠感染 CA4/CA7流感病毒存活率Fig.1 Survival rate ofmice infected CA7/CA4 virus

2.2 临床症状

感染小鼠早期表现出食欲减退、消瘦;后期出现被毛逆立、弓背、反应迟钝、眼半闭等。

2.3 肺脏湿重和肺指数变化

感染小鼠平均肺重为 0.13 g;同一攻毒剂量组死亡小鼠的平均肺指数为 (0.03±0.01)g～(0.05 ±0.01)g。死亡小鼠的肺脏湿重增加明显,和对照组 (0.007±0.0005)g比差异极显著 (P<0.01)。死亡小鼠的肺指数也相应增高,和对照比差异显著(P<0.05)。

2.4 感染小鼠病理变化结果

剖检可见感染小鼠肺脏有明显充血和水肿,肺体积变大,肺组织表面有局部轻度实变,呈斑点状充血,其它脏器未见明显异常。CA7 106～104TC ID50重度弥漫性间质性肺炎,103TC ID50中度-重度间质性肺炎,102TC ID50局灶性肺炎。CA4 106TC ID50中度-重度间质性肺炎,105TC ID50中度间质性肺炎局灶性肺炎。与 CA4相比,CA7造成的肺脏病变较弥漫,肺泡上皮细胞病变明显;CA7在较低浓度时 (103～102TC ID50),造成的肺组织损伤范围相对局限,但也可合并细菌感染在肺组织局部引起严重病变(图 2见彩插 1)。

2.5 感染小鼠脏器病毒滴度的测定

图 3 感染小鼠肺组织的 TC ID50结果Fig.3 TC ID50of lungs infected mice

CA7 106TC ID50感染小鼠后,感染后每天安乐 3只小鼠,取肺组织做病毒滴度培养,用 Reed-Muench法计算死亡小鼠不同脏器内病毒含量 (TC ID50/0.02 mL)。根据肺组织的组织培养滴度得到病毒在小鼠体内复制的动态变化曲线,3～5 d病毒复制达到高峰,此后病毒复制开始下降 8 d内仍在排毒 (图 3)。肾、脑、肝、脾未分离出病毒。

2.6 感染小鼠脏器的 RT-PCR检测结果

随机抽取死亡小白鼠的各脏器样品进行流感病毒RT-PCR扩增,通过组织中 GAPDH来定量组织块大小,取大小相同的组织块进行 RT-PCR(图 4),结果在肺、脑、气管、肝、脾、肾、肝中均扩增到目的基因片段,跑胶可见 153 bp核酸条带 (图 5)。

图4 组织中GAPDH跑胶条带Fig.4 PCR products of GAPDH in tissues

图 5 死亡小鼠各脏器 RT-PCR扩增结果Fig.5 Results of RT-PCR on organs ofmice

3 讨论

A/California/7/2009与 A/California/4/2009两株病毒进行序列分析,同源性在 99%以上,比较两株病毒株的感染力强弱。两株病毒在细胞水平上以相同 TC ID50病毒感染MDCK细胞,CA4病变时间长于 CA7。以相同 TC ID50病毒在鸡胚上传代后CA4HA滴度较低。

以相同 TC ID50感染 BALB/c小鼠,与 CA4相比,CA7造成的肺脏病变较弥漫,肺泡上皮细胞病变明显;CA7在较低浓度时 (10-3及 10-4),造成的肺组织损伤范围相对局限,但也可合并细菌感染在肺组织局部引起严重病变。

CA4和 CA7两株病毒 99%的同源性,以相同剂量感染小鼠后,临床病理表现有显著性差异,CA7感染的小鼠的临床症状出现的早,体重下降快,症状出现早,存活时间短,死亡快,且死亡率高。CA4感染小鼠后 14 d死亡率 20%,CA7感染小鼠后 8 d内死亡率 100%。实验结果显示,H1N1甲型型流感病毒CA4/CA7可以感染BALB/c小鼠,其中 CA7感染小鼠后表现出高感染率和致死率,感染症状与 CA4病毒株感染小鼠有显著性差异。CA4感染小鼠后表现比较温和。

[1] 杨松涛,高玉伟,夏咸柱,等.虎源 H5N1亚型禽流感病毒感染小鼠模型的建立[J].中国病毒学,2006,21(4):253-357.

[2] Belser JA,Lu XH,Taronna R,et al. Pathogenesis of avian influenza(H7)virus infection in mice and ferrets:enhanced virulence of Eurasian H7N7 viruses isolated from humans[J].J Virol,2007,81:11139-11147.

[3] Banks J,Speidel EC,McCauley JW,et al.Phylogenetic analysis of H7 haemagglutinin subtype influenza A viruses[J].Arch Virol, 2000,145:1047-1058.

[4] Bitko V,Musiyenko A,Barik S. Viral infection of the lungs through the eye[J].J Virol,2007,81:783-790.

[5] Capua I,Alexander DJ.Avian influenza:recent developments [J].Avian Pathol,2004,33:393-404.

[6] Dybing JK,Stacey SC,Swayne DE,et al.Distinct pathogenesis of hong kong-origin H5N1 viruses in mice compared to that of other highly pathogenic H5 avian influenza viruses[J].J Virol,2000, 74:1443-1450.

[7] Fouchier RA,Schneeberger PM,Rozendaal FW,et al.Avian influenza A virus(H7N7)associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome[J].Proc NatlAcad SciUSA,2004,101:1356-1361.

[8] 殷震,刘景华.动物病毒学[M].北京:科学出版社,1997.

I nfectivity Comparison between A/Californ ia/7/2009 and A/Californ ia/4/2009

BAO Lin-lin,SUN Hui-hui,ZHAN Ling-jun,DENGWei,XU Li-li,ZHU Hua, XUN Yan-feng,ZHANGLian-feng,Q IN Chuan
(Center of ComparativeMedicine,Institute ofLaboratoryAn imal Science,CAMS&PUMC,Beijing 100021,China)

ObjectiveTo compare the infectivity of H1 subtype influenza A virusesA/California/7/2009 and A/ California/4/2009,which the nucleotide sequence homology of two subtypes is 99% in BALB/c mice。MethodsA/California/7/2009(CA7)andA/California/4/2009(CA4)were additionally used in infectivity studies.FemaleBALB/ c mice(15～18 g)were anesthetized by inhalation of ether and inoculated intranasally with 0.03 mL of infectious virus CA4 or CA7.Briefly,mice were infected with ten-fold dilutions of each virus.Mice were observed daily for 8 days for clinical signs of infection and day of survival。ResultsCA4 and CA7 infected mice in the same TC ID50.2 mice of 10 infected by CA4 died in 14 days,on the other hand 10 mice infected CA7 were all dead in 8 days.Severe interstitial pneumonia characterized by necrosis and inflammation cells in mice infected CA7 and mild interstitial pneumonia in mice infected CA4。ConclusionThe data demonstrate that the CA7 hasmore infectivity than CA4 in the same TC ID50.

A/California/7/2009;A/California/4/2009;H1N1;BALB/c mice

R373

A

1671-7856(2010)01-0006-04

2009-10-30

科技重大专项-艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治:2009ZX10004-402;卫生公益性行业科研专项项目:200802036;中央级公益性科研院所基本科研业务费:DWS200810。

鲍琳琳,助理研究员,研究方向:艾滋病免疫治疗。

秦川,教授,博士生导师。E-mail:chuanqin@vip.sina.com

张连峰,教授,博士生导师。E-mail:zhanglf@cilas.org