相 婕,许栋明,王 文,云彩麟,张 丽,艾厚喜,李 林

(1.内蒙古医学院药学院,呼和浩特 010059;2.首都医科大学宣武医院药物室,教育部神经变性病学重点实验室,北京 100053;3.科技部火炬高技术产业开发中心,北京 100038)

研究报告

莫诺苷对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤神经功能的影响

相 婕1,许栋明3,王 文2,云彩麟1,张 丽2,艾厚喜2,李 林2

(1.内蒙古医学院药学院,呼和浩特 010059;2.首都医科大学宣武医院药物室,教育部神经变性病学重点实验室,北京 100053;3.科技部火炬高技术产业开发中心,北京 100038)

目的观察中药山茱萸的有效成分莫诺苷对大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经功能的影响。方法W istar雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、莫诺苷小剂量组 (30 mg/kg)、莫诺苷中剂量组 (90 mg/kg)、莫诺苷大剂量组 (270 mg/kg)、维生素 E(VE)(35 mg/kg),采用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,缺血 30 min后再灌注 3 d,应用 Zea Longa法、爬网格、平行木、吊绳、Ludmila Belayev 12分评分法,观察莫诺苷对神经功能缺损的改善作用。结果与模型组比较,莫诺苷给药组(小、中、大剂量)Zea Longa法评分均差异极显著﹙ P<0.01);与模型组比较,莫诺苷给药组 (小、中、大剂量)吊绳法评分均差异极显著 (P<0.01);Ludmila Belayev 12分评分法评分与模型组比较,莫诺苷大剂量组差异极显著﹙ P<0.001),中剂量组差异极显著﹙ P<0.01)。结论莫诺苷对局灶性脑缺血再灌注模型大鼠有改善行为学评分的作用。

莫诺苷;大鼠;局灶性脑缺血再灌注;神经功能;行为学

缺血性脑卒中是由于脑血流受阻而导致的神经损伤和凋亡,表现为神经功能障碍甚至死亡[1],具有发病率高、死亡率高、致残率高的特点。其高致残率给社会和家庭均带来沉重的负担,但其治疗手段却十分有限[2],因此从天然药物中开发新的脑保护药显得十分重要。以往研究发现山茱萸环烯醚萜苷对D-半乳糖致脑老化痴呆小鼠模型及光化学诱导的脑梗死大鼠模型均具有改善作用,并能提高隔海马穹隆伞切断拟Alzhe imer病(AD)模型大鼠的学习记忆功能,明显减少模型鼠内侧隔核区和海马齿状回多形层神经元的丧失[3-5]。莫诺苷是山茱萸环烯醚萜苷的主要成分之一,研究发现莫诺苷具有抗氧化损伤和抗凋亡等神经保护作用[6,7]。本实验观察莫诺苷对局灶性脑缺血再灌注模型大鼠神经功能缺损的影响。

1 材料和方法

1.1 药物与试剂

莫诺苷由本室从山茱萸中提取制备,用 HPLC分析,纯度 98.5%。维生素 E:北京双鹤药业。

1.2 实验动物分组及给药

60只 SPF级W istar雄性成年大鼠,体重 260～280 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2007-0001]。随机分为:假手术组,模型组,莫诺苷小 (30 mg/kg)、中 (90 mg/kg)、大 (270 mg/kg)剂量组和维生素 E组 (35 mg/kg)各 10只。采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,术后连续灌胃给药 3 d,每天给药 1次,其中假手术组和模型组给予等量生理盐水。

1.3 模型制备

局灶性脑缺血再灌注模型采用改良 Zea Longa's线栓法[8]制备。大鼠用 10%水合氯醛 0.35 mL/kg腹腔注射麻醉,钝性分离右侧颈总动脉 (CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉 (I CA),结扎颈外动脉和颈总动脉的近心端。在颈总动脉接近颈外动脉和颈内动脉分叉处用眼科剪作一斜行细切口,将直径为0.26 mm的尼龙线插入,推动尼龙线进入颈内动脉,进入距颈外动脉和颈内动脉分叉处约 2 cm时,会有阻挡感,说明栓线已越过 MCA,到达大脑前动脉(ACA)的起始部。记录栓塞开始时间。缝合肌肉、皮肤。栓塞后 30 min拔出尼龙线。假手术组的大鼠,除不插入尼龙线外,其他操作与手术组相同。

1.4 神经功能学评价

术后待动物清醒后及连续灌胃给药 3 d后分别进行行为学评分。

1.4.1 Zea Longa法 (Zea Longa's method)(5分)[8,9]:0分:无神经功能损伤;1分:轻微神经功能缺损,不能完全伸展对侧前爪;2分:对侧前肢屈曲; 3分:轻度向对侧转圈;4分:严重向对侧转圈;5分:对侧偏瘫。

1.4.2 爬网格 (Grid test)(5分)[10]:计数大鼠前后肢每米漏空次数以评价前后肢的运动协调能力。0分:无错误;1分:≤1次错误 (1次);2分:>1次错误 (2次);3分:>2次错误(3次);4分:>3次错误(>3次);5分:不能前进。

1.4.3 平行木 (Beam-walking test)(5分)[11]:计数大鼠穿越平行木跌倒次数以评价运动协调能力。0分:穿过平行木不跌倒;1分:穿过平行木跌倒机会<50%;2分:穿过平行木跌倒机会 >50%;3分:穿过平行木,但受累的瘫痪后肢不能帮助向前移动;4分:不能穿过但可坐在上面;5分:放在平行木上会掉下来。

1.4.4 吊绳 (Prehensile traction test)(3分)[12]:记录大鼠前爪抓握时间以评价前肢肌力。0分:5 s以上并且后腿可以放在绳上;1分:5 s;2分:3～4 s;3分:0～2 s。

1.4.5 Ludmila Belayev 12分评分法 (Ludmila Belayev'smethod)[13]:提尾悬空 (2分)0分:无明显神经功能缺失;1分:梗死对侧肢体轻度屈曲;2分:梗死对侧肢体屈曲明显。

肢体放置,分为视觉亚试验 (前方、侧方)和触觉亚试验 (前方、侧方)(8分)0分:动物肢体放置反应正常;1分:反应延迟但不超过 2 s;2分:反应延迟且 >2 s。

本体觉亚试验 (2分)0分:与对侧比肢体同样有力;1分:与对侧比肢体稍有力;2分:与对侧比肢体无力。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 Zea Longa法(Zea Longa's method)[8,9](5分)

术后当天,测得 Zea Longa评分,各组分别与假手术组 (0.00±0.00)比较,模型组 (3.80±0.31)、莫诺苷小剂量组 (3.80±0.17)、莫诺苷中剂量组(3.70±0.21)、莫诺苷大剂量组 (3.30±0.33)、维生素 E组 (3.20±0.31)均差异极显著 (P<0.001),表明手术组有显著的神经功能损伤;连续灌胃给予莫诺苷 3 d后,测得 Zea Longa评分,各组分别与模型组 (3.00±0.52)比较,莫诺苷小剂量组 (1.50± 0.22)、莫诺苷中剂量组 (1.70±0.21)、莫诺苷大剂量组 (1.30±0.33)均差异极显著 (P<0.01),维生素 E组 (1.00±0.45)有极显著性差异 (P<0.001),表明莫诺苷给药组大鼠神经功能有显著的恢复 (图1)。术组有显著的神经功能损伤;连续灌胃给予莫诺苷3 d后,测得吊绳评分,各组分别与模型组 (2.80± 0.70)比较,莫诺苷小剂量组 (3.80±0.48)、莫诺苷中剂量组 (3.80±0.79)、莫诺苷大剂量 (3.50± 0.50)、维生素 E组 (2.30±0.71)均有降低评分的趋势,对损伤的神经功能有一定的恢复作用(图 2)。

图 1 Zea Longa法评分结果Fig.1 The effect of Zea Longa'smethod

2.2 爬网格(Grid test)[10](5分)

术后当天,测得爬网格评分,各组分别与假手术组 (0.70±0.21)比较,模型组 (4.00±0.37)、莫诺苷小剂量组 (4.30±0.33)、莫诺苷中剂量组 (4.50 ±0.22)、莫诺苷大剂量组 (4.50±0.34)、维生素 E组 (3.80±0.17)均差异极显著 (P<0.001),表明手

图 2 爬网格评分结果Fig.2 The effect of Grid test

2.3 平行木(Beam-walking test)[11](5分)

术后当天,测得平行木评分,各组分别与假手术组 (1.20±0.40)比较,模型组 (3.70±0.61)、莫诺苷小剂量组 (3.80±0.40)、莫诺苷中剂量组 (3.80 ±0.40)、莫诺苷大剂量组 (4.70±0.21)均差异极显著 (P<0.001),维生素 E组 (2.80±0.48)有显著性差异(P<0.05),表明手术组有显著的神经功能损伤;连续灌胃给予莫诺苷 3 d后,测得吊绳评分,各组分别与模型组(2.80±0.79)比较,莫诺苷小剂量组 (3.50±0.84)、莫诺苷中剂量组 (3.30± 0.67)、莫诺苷大剂量 (2.80±0.48)、维生素 E组(2.50±0.50)有降低评分的趋势,对损伤的神经功能有一定的恢复作用(图 3)。

2.4 吊绳(Prehensile traction test)[12](3分)

术后当天,测得吊绳评分,各组分别与假手术组(0.20±0.17)比较,模型组 (2.30±0.33)、莫诺苷小剂量组 (2.00±0.37)、莫诺苷中剂量组 (2.20± 0.31)、莫诺苷大剂量组(2.50±0.22)、维生素 E组(2.20±0.40)均差异极显著(P<0.001),表明手术组大鼠有显著的神经功能损伤;连续灌胃给予莫诺苷 3 d后,测得吊绳评分,各组分别与模型组 (1.20 ±0.48)比较,莫诺苷小剂量组 (0.20±0.17)、莫诺苷中剂量组 (0.20±0.17)、莫诺苷大剂量 (0.20±0.17)、维生素 E组 (0.00±0.00)均差异极显著 (P <0.01),表明莫诺苷给药组大鼠神经功能有显著的恢复(图 4)。

图 3 平行木评分结果Fig.3 The effect ofBeam-walking test

图4 吊绳评分结果Fig.4 The effect of Prehensile traction test

2.5 Ludm ila Belayev 12分评分法 (Ludm ila Belayev'smethod)[13]

术后当天,测得 Ludmila Belayev 12分评分,各组分别与假手术组 (0.00±0.00)比较,模型组(9.30±0.92)、莫诺苷小剂量组 (8.50±0.76)、莫诺苷中剂量组 (9.20±1.05)、莫诺苷大剂量组(9.20±1.01)、维生素 E组(7.50±1.06)均差异极显著(P<0.001),表明手术组大鼠有显著地神经功能损伤;连续灌胃给予莫诺苷 3 d后,测得 Ludmila Belayer 12分评分,各组分别与模型组 (6.30± 1.17)比较,莫诺苷大剂量组 (3.00±0.82)、维生素E组 (2.30±1.58)均差异极显著 (P<0.01)、莫诺苷中剂量组 (4.00±0.58)具有显著性差异 (P< 0.05),表明莫诺苷给药组大鼠神经功能有显著的恢复(图 5)。

图 5 Ludmila Belayev 12分评分法结果Fig.5 he effect ofLudmila Belayev'smethod

3 讨论

在脑缺血早期,自由基损伤、兴奋性神经毒性和反复细胞膜去极化导致能量衰竭,引起级联式“瀑布反应”,破坏了“神经血管单元”(neurovascular unit)[14]稳态,导致神经元凋亡以及微血管、血脑屏障破坏。脑组织由于缺血缺氧,能量耗竭而导致脑细胞缺血坏死,相应支配区出现运动、感觉和语言障碍。局灶性脑缺血神经症状的主要特点为缺血对侧的肢体瘫痪或神经肌肉运动功能缺损[15],促进缺血后的神经功能的恢复是临床考查重要指标,也是脑保护药物开发研究的重点之一。

本研究采用了大鼠 tMCAO/R模型,造成局部脑缺血再灌注损伤,模型鼠出现了手术侧表现出Honer症出现强迫体态和对侧前肢偏瘫,爬行时向偏瘫侧转圈、追尾等相应症状[16,17],Zea Longa法、吊绳、Ludmila Belayev12分评分数据统计结果显示,手术组与假手术组比较均具有非常显著性差异。

本实验选择脑缺血再灌注 3 d的目的在于考查莫诺苷在急性期对模型鼠的患肢感觉、运动和肌力功能的恢复作用。Zea Longa[8,9]法评测大鼠前肢的运动能力,莫诺苷给药组大鼠前肢的运动能力有改善(P<0.01),同时与对侧肢体相比较,肢体的不平衡性有一定程度的降低。吊绳[12]考查大脑中动脉栓塞再灌注大鼠前肢肌力恢复状况,莫诺苷给药组大鼠的前肢肌力有明显的恢复 (P<0.01),吊绳平均持续时间大于 5 s。Ludmila Belayev 12分评分法[13]检测前后肢的感觉、运动能力,术后模型组大鼠患侧的肢体感觉迟钝,视觉损伤,肢体屈曲严重,给药 3 d后,大鼠患侧肢体感觉明显改善,视觉有所恢复,肢体屈曲度有所降低 (P<0.05)。爬网格法[10]和平行木法[11]观察前后肢的运动协调度,实验中我们发现莫诺苷给药组有增加肢体的运动协调能力的趋势,统计无差异。实验结果表明,莫诺苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠的神经功能有改善作用,具有促进恢复模型鼠前肢、肌肉的感觉、运动能力和肌力的作用。本课题前期研究发现莫诺苷具有抗氧化应激和抗凋亡的作用[6,7],提示抗氧化应激和抗凋亡可能是莫诺苷促进神经血管单元再生与神经功能的恢复的机制之一,在促进神经功能恢复方面具有良好的应用前景。

[1] Baker K,BucayMarcus C,Huffman K,et al.Synthetic combined superoxide dis mutase/catalasemimetics are protective as a delayed treatment in a rat stroke:a key role for reactive oxygen species in ischemic brain injury[J].J Pharmacol Exp Ther,1998,284:215 -221.

[2] Whisnant JH.The decline of stroke[J].Stroke,1984,15:160-168.

[3] 王文,黄文婷,艾厚喜,等.中药诱导脑成体神经干细胞的增殖分化[J].中国康复理论与实验,2007,13(1):26-28.

[4] 陆华宝,李林,安文林,等.中药 SSY-B2对隔海马穹窿伞切断致大鼠学习记忆障碍的改善作用[J].中国康复理论与实践,2003,9(5):286-288.

[5] 陆华宝,李林,安文林,等.中药 SSY-B2促进中枢神经系统损伤后轴突再生的分子机制[J].中国康复理论与实践,2003, 9(7):410-412.

[6] WangW,HuangWT,LiL,et al.Morroniside prevents peroxideinduced apoptosis by induction of endogenous glutathione in human neuroblastoma cells[J].Cell Mol Neurobiol,2008,28: 293-305.

[7] WangW,Sun FL,An Y,et al.Morroniside protects human neuroblastoma SH-SY5Y cells against hydrogen peroxide-induced cytotoxicity[J].Eur J Phar macol,2009,613:19-23.

[8] Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke, 1989,20(1):84-91.

[9] Bederson JB,PittsLH,TsujiM,et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation ofthe modeland development ofa neurologic examination[J].Stroke,1986,17(3):472-476.

[10] Hernandez TD,SchallertT. Seizures and recovery from experimental brain damage[J].Exp Neurol,1988,102:318-324.

[11] Chen JI,Li Y,WangL.et al.Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells aftercerebral ischemia in rats[J].Stroke,2001,32:1005-1011.

[12] Li JS,Zhang W,Kang Z M, etal. Hyperbaric oxygen preconditions reduces ischaemia-reperfusion injure by inhibition of apoptosis via mitochondrial pathway in rat brain[J]. Neuroscience,2009,159:1309-1315.

[13] BelayevL,Alonso OF,Busto R,et al.Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture neurological and pathological evaluation of an improved model[J].Stroke,1996, 27:1616-1623.

[14] Lo EH,Dalkara T,Moskowitz MA.Mechanisms,challenges and opportunities in stroke[J].Nature Rev Neurosci,2003,4(5): 399-415.

[15] Jackie H,Kenneth M,Derek R.To what extent have functional studies of ischaemia in animals been useful in the assessment of potential neuroprotective agents[J]?TiPS,1998,19:59-66.

[16] 胡建鹏,王键.线栓法大鼠局灶性脑缺血模型研究中的几个问题[J].中国比较医学杂志,2004,(14)2:115-118.

[17] 何学令,尹海林.脑缺血动物模型的研究进展[J].中国比较医学杂志,2004,(14)4:249-252.

M orron iside Ameliorate Focal Cerebral Ischaem ia-reperfusion Injury Induced Neurological Function Deficits in Rats

X IANG Jie1,XU Dong-ming3,WANGWen2,YUN Cai-lin1,ZHANGLi2,A IHou-xi2,L ILin2
(1.Department of Pharmacy,InnerMongoliaMedical College,Hohhot 010059,China; 2.Department of Pha rmacology,Xuanwu Hospital of CapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China;3.Torch High Technology IndustryDevelopment Center,TheMinistry of Science and Technology of the P.R.C.,Beijing 100038,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Morroniside which was isolated from Cornus of ficinalis on recovery of neurological function after focal cerebral ischemia reperfusion in rats。MethodsW istar male rats were randomly divided into sham operated group,model group and Morroniside-low(30 mg/kg),Morroniside-middle(90 mg/ kg),Morroniside-high(270 mg/kg),vitamin E(35 mg/kg).Focal stroke was induced in adult rats by 30 minutes right middle cerebral artery occlusion reperfusion injury( tMCAO/R).To examine the recovery of neurological function,we measured Zea Longa'smethod,Grid test,Beam-walking test,Prehensile traction test,Ludmila Belayev'smethod on the third day after operations in rats.Result The above mentioned indexes,including Zea Longa's method,Prehensile traction testin theMorroniside-treated group showed differences compared with those in the model group(P<0.01)on the third day after the rightmiddle cerebral artery occlusion reperfusion injury( tMCAO/R)in rat,and Ludmila Belayev'smethod in the Morroniside-treated group showed differences compared with those in the model group (P<0.001). Conclusion Morroniside ameliorate focal cerebral ischaemia-reperfusion injury induced neurological function deficits in Rats.

Morroniside;Rat;Focal cerebral ischemia reperfusion;Neurological function;Behavior tests

R743.31

A

1671-7856(2010)01-0010-05

2009-09-07

“重大新药创制”科技重大专项 (2009ZX09103-366),国家自然科学基金项目 (30740053);北京市自然科学基金项目(7062031)。

相婕(1984-),女,硕士生,主要研究方向:神经药理、中药药理。E-mail:xj_840129@yahoo.cn

王文,男,博士,副研究员,主要从事天然药物对脑重大疾病干预研究。E-mail:lzwwang@yahoo.com.cn

云彩麟,女,硕士,教授,主要从事神经药理学、毒理学与中蒙药药理的研究。E-mail:nmycl@163.com