全雄志,董 伟,曹兴水,张连峰

(中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心,卫生部人类疾病比较医学重点实验室,北京 100021)

研究报告

24-脱氢胆固醇还原酶基因转基因小鼠血生化指标分析

全雄志,董 伟,曹兴水,张连峰

(中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心,卫生部人类疾病比较医学重点实验室,北京 100021)

目的建立全身表达 24-脱氢胆固醇还原酶基因(Dhcr24)转基因小鼠动物模型,研究该基因过表达对小鼠代谢的影响。方法RT-PCR法克隆小鼠Dhcr24基因,把该基因插入 CMV启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立Dhcr24转基因小鼠。PCR鉴定Dhcr24转基因小鼠的基因型,RT-PCR和WesternBlot检测基因表达水平,血生化检测仪检测转基因小鼠血生化指标的改变。结果建立了2个不同表达水平的Dhcr24转基因小鼠品系,转入的 Dhcr24基因在肝和脾组织中的表达高于内源的 Dhcr24。血生化检测证实:乳酸脱氢酶(LDH)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)和血肌酐(SCr)较野生型小鼠明显降低,而高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-c)和碱性磷酸酶(ALP)较野生型小鼠明显增加,并且 Dhcr24转基因雌鼠的体重比野生型小鼠明显降低,均有显著差异。但Dhcr24转基因雄鼠各项指标与野生型小鼠相比没有显著差异。结论成功建立了全身表达 Dhcr24转基因小鼠,并证实Dhcr24基因对雌性小鼠的体重和血生化指标,包括 LDH,TP,Alb,SCr,HDL-c and ALP具有明显的影响。

24-脱氢胆固醇还原酶;转基因小鼠;血生化指标

胆固醇是动物体内必不可少的一种生物分子,是类固醇激素和胆汁酸的前体,也是制造副肾皮质激素和性激素的材料。除了是细胞膜、脂质筏和细胞膜穴样内陷的主要组成部分外,还参与蛋白质修饰过程[1-3]。但是,如果体内胆固醇过多,就会造成动脉硬化、狭心症、心肌梗死、中风、糖尿病和中枢性眩晕等疾病。24-脱氢胆固醇还原酶基因 (24-Dehydrocholesterol reductase,Dhcr24)编码的蛋白为516个氨基酸组成的多肽,催化 24-脱氢胆固醇的δ-24位双键的加氢反应,产生的胆固醇,是胆固醇合成的最后一步。Dhcr24的活性依赖黄素腺嘌呤二核苷酸的存在[4]。Dhcr24在肾上腺、脑的延髓、脑桥、前列腺,肝脏、心脏、卵巢和肠等组织中均有表达[5,6]。本文通过转基因技术,将 Dhcr24基因转入 C57BL/6J小鼠,建立全身表达 Dhcr24转基因小鼠,并分析了Dhcr24基因对血脂和其他血液生化指标的影响。

1 材料和方法

1.1 Dhcr24表达载体的构建及转基因

Trizol法提取小鼠心脏总 RNA(Invitrogen公司),用逆转 PCR扩增 C57BL/6J小鼠全长的Dhcr24 cDNA,把扩增片段插入 pMD-18T载体,进行测序(北京三博远志生物技术有限公司,中国)。以Hind III和 Xho I进行酶切回收该片段,基因克隆入CMV启动子下游,构建 Dhcr24转基因载体。转基因载体用 Not I线性化 (宝生物工程有限公司,中国),调整浓度至 5 ng/μL,用显微注射法将线性化的基因载体注射到 C57BL/6J小鼠的受精卵中[小鼠购自中国医学科学院实验动物研究所,康蓝公司XCXK(京)2004-001],用 I CR小鼠作假孕受体[I CR小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司,XCXK(京)2007-0001],制备转基因小鼠(TE2000-U显微注射仪)[7]。实验中涉及动物的操作程序已经得到医学科学院实验动物研究所动物福利和管理委员会的批准,批准号为 GC-07-2010。

1.2 PCR鉴定Dhcr24转基因小鼠的基因型

转基因小鼠在出生 9～14 d用剪趾法标记,收集剪下的组织,用碱解法提取基因组 DNA[8],用PCR对转基因小鼠进行基因表型检测,PCR引物为5′-GGGACATCCAGAAACAGGTCC-3′和 5′-GACGGT GTGCAGCGCACAAAG-3′(上海生物工程技术有限公司,中国)。PCR反应体系为 20μL(试剂购自宝生物工程有限公司,中国),反应条件:94℃预变性 3 min,94℃变性 30 s,54℃退火 30 s,72℃延伸 30 s,重复变性至延伸 29次,完成 30个循环。目的基因Dhcr24片断为 390 bp。

1.3 RT-PCR和W estern Blot检测鉴定 Dhcr24基因的表达

Trizol法提取 4只 Dhcr24转基因 F1代 3月龄和同月龄野生小鼠的脾脏总 RNA。RT-PCR扩增目的基因片段的引物为上游 5′-GGGACATCCAG AAACAGGTCC-3′和下游 5′-GGGCTCCACTCGA ACAATCTGT-3′,目 的 片 段 大 小 为 196 bp, Glyceraldegyde-3-phosphate(GAPDH)内参上游引物为 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′,下游引物为5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,扩增片段大小为 451 bp。分别提取 4只Dhcr24转基因 F1代 3月龄和同月龄野生小鼠的脾脏总蛋白,进行 SDSPAGE凝胶电泳,将蛋白条带转移到 NC膜上 (购自Millipose公司),置于 5%脱脂奶粉封闭液中,室温下 1 h。加入1∶100羊抗 Dhcr24单克隆抗体 (购自Santa Cruz,美国),室温 1 h后,置于 4℃过夜。将膜取出,用 TBST洗膜 3次,每次 10 min。加入 1: 10000辣根过氧化物酶标记兔抗羊二抗 (购自Pierce,美国)和1∶10000抗 GAPDH抗体作为内对照(购自康成生物,中国),室温摇床摇动 1 h。取出膜,用 TBST洗膜 2次,TBS洗膜 1次,每次 10 min。将膜置于化学发光液中 (购自 Santa Cruz,美国),曝光、显影及定影。

1.4 血生化检测Dhcr24转基因小鼠

选用 1月龄的转基因阳性和野生型雄性小鼠各6只以及雌性小鼠各 6只,禁食 12 h后,记录各自的体重,眼眶静脉采血,室温静置 2 h后,3000 r/min, 4℃离心 15 min分离血清,根据临床检验程序检查血生化指标(日立 7020,日本)。

2 结果

2.1 Dhcr24表达载体的构建和转基因小鼠基因表型的鉴定

用 RT-PCR克隆小鼠 Dhcr24 cDNA,测序结果表明克隆的 cDNA同已报道的 Dhcr24序列完全一致(GenBank No.NM_053272)。将该基因插入全身特异表达的 CMV的下游,构建 Dhcr24转基因载体(图 1)。

图 1 Dhcr24转基因表达载体Fig.1 Dhcr24 transgenic construct

用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,转入到假孕受体 ICR小鼠中,小鼠出生后9～14 d提取基因组DNA,用 PCR扩增Dhcr24目的基因 390bp的片段来鉴定 Dhcr24转基因小鼠 (图 2),共得到 4只首建鼠,均可传代,留下两个表达水平较高的保种,并进行表型分析。

图 2 PCR鉴定Dhcr24转基因小鼠的凝胶电泳分析Fig.2 Deter mination of the transgenic mouse with PCR

2.2 Dhcr24基因的表达

RT-PCR扩增心脏 Dhcr24。产物长度为 196 bp。GAPDH内参的长度为 451 bp,结合 Western blotting,结果显示:首建鼠 2和 3的 Fl代 3月龄小鼠Dhcr24基因表达水平明显要高于野生型 (图 3, 4)。

2.3 Dhcr24转基因小鼠的体重和血生化指标检查结果

图 3 RT-PCR鉴定Dhcr24转基因小鼠表达Fig.3 Deter mination of the transgenic mouse with RTPCR

图 4 Western Blot分析Dhcr24基因在脾中的表达Fig.4 Deter mination ofthe transgenicmice gene expression withWestern Blot

图 5 3月龄DHCR24转基因雌鼠和同月龄野生型小鼠体重比较Fig.5 Comparison of the body weight be tween the female wild type and the transgenic mice at the age of three month

1月龄 Dhcr24转基因小鼠和同龄野生型小鼠进行体重 (图 5)和血生化指标分析 (表 1),结果显示,转基因雌鼠的体重比同龄野生小鼠减轻了18.5%(P<0.01)。血生化指标检测分析证实,转基因雌性小鼠与野生小鼠相比,血液 TP降低了11.9%(P<0.01),Alb降低了 13.3%(P<0.05), LDH降低了 41.0%(P<0.01),SCr降低了 20.0%(P<0.01)。而一龄转基因雌性小鼠比野生小鼠相比,血液 HDL-c增加了 33.3%(P<0.01),ALP增加 105.2%(P<0.01)。

表 1 雌性野生型和转基因小鼠血生化指标的比较Tab.1 Comparison of the blood chemistry between the female wild type and the transgenic mice at the age of three month

3 讨论

本研究经过 RT-PCR和Western Blot筛选,得到2个高表达 Dhcr24基因的转基因小鼠品系。在一月龄,转基因雌鼠比同龄野生小鼠的 LDH、TP、Alb和 SCr分别降低 41.0%、18.5%、13.3%和 20.0%,而 HKL-c和 ALP则各增加了 33.3%和 105.2%。除了Alb具有显著差异 (P<0.05)外,其它指标均为高度显著差异 (P<0.01)。同时,转基因雌鼠的体重比同龄野生小鼠减轻了 18.5%(P<0.01)。

乳酸脱氢酶 (1actate dehydrogenase,LDH)是人体糖酵解途径中一种重要代谢酶,能催化乳酸脱氢生成丙酮酸,主要分布于肾脏、心肌、肝脏、红细胞和白细胞等组织细胞的胞质中,其中以肾脏含量较高[9]。有研究表明,雌激素可参与调节心肌组织CK、LDH及AST的生成[10],大鼠摘除卵巢两周后,血中浓度显著降低,心肌组织 CK、LDH及AST活性也明显降低[11]。本实验显示,DHCR24转基因雌鼠和同龄野生小鼠相比,LDH明显降低,而雄性组却没有变化。说明转基因雌鼠血乳酸水平升高可能与机体抗疲劳能力、机体肝糖原和肌糖原的贮备以及肾脏、骨骼肌、肝脏及心肌耐缺氧能力减弱有着一定的联系,也可能是DHCR24转基因雌鼠的雌激素分泌受到的一定的抑制。

血清蛋白质 (total protein,TP)是各种蛋白的复杂混合物,是人体内重要的运输载体,是维持渗透压的重要成分,也是了解营养状况以及机体蛋向质代谢状况的一个重要指标。对血浆蛋白各组分含量的测定有助于提供有价值的生理信息[12]。而白蛋白(albumin,Alb)是由肝实质细胞合成,是血浆中含量最多的蛋白质,占血浆总蛋白的 40%～60%,其合成率虽然受食物中蛋白质含量的影响,但主要受血浆中白蛋白水平调节。当肝脏发生病变时,肝细胞合成蛋白质的功能减退,血浆中蛋白质即会发生质和量的变化,白蛋白也随之降低,如肝硬变合并腹水及其他肝功能严重损害、营养不良、慢性消化疾病和肾病综合征等。血清总蛋白 (TP)、白蛋白 (Alb)的测定可作为评价营养及消化功能的指标,了解体内蛋白质代谢的状况,其含量的变化还与外界环境有关[13]。有研究表明,在低氧的条件下,大鼠血浆中的 TP和Alb明显降低[14]。DHCR24转基因雌鼠机体合成蛋白能力受阻,可能导致肝脏、肾脏的病变和机体耐缺氧能力减弱。并且,由于体内蛋白质减少,造成营养不良,这可能是直接影响到Dhcr24转基因雌鼠体重下降的主要因素。这需要对转基因雌鼠做进一步的代谢和氧耗实验来说明这一点。

肌酐 (creatinine,Cre)是肌肉在人体内代谢的产物,肌酐主要由肾小球滤过排出体外。血中肌酐来自外源性和内源性两种,外源性肌酐是食物在体内代谢后的产物;内源性肌酐是体内肌肉组织代谢的产物[15]。而 Dhcr24转基因雌鼠血肌酐的降低说明Dhcr24基因可能影响了小鼠摄食量或者肾脏肾小球滤过功能受损,这需要作进一步的研究分析。

碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase,ALP)是一种磷酸单酯酶,广泛存在于人体组织和体液中,血清ALP主要来自肝胆系统、骨骼及肠道。胆道系统是ALP产生的主要部位[16],ALP测定主要用于肝病和骨病的临床诊断,当肝内和肝外胆汁排泄受阻时,肝组织表达的 ALP不能排出体外而回流入血导致ALP的升高。ALP在肝脏中主要分布于肝细胞的血窦内侧和毛细胆管侧的微绒毛上,经胆汁排入小肠,当毛细胆管内压升高,可诱发 ALP产生增多[17]。

高密度脂蛋白主要是由肝脏合成,它是由载脂蛋白、磷脂、胆固醇和少量脂肪酸组成。高密度脂蛋白胆固醇 (high-density lipoprotein cholesterol,HDL-c)的功能特性是助长胆固醇从动脉壁向肝脏运送,并经肝转化代谢。因此,HDL-c能将胆固醇从肝外组织转运到肝脏进行代谢,并以胆汁形式排出体外,并具有限制LDL-c微粒的氧化作用,从而减慢血管内斑块的形成。但是,当体内出现感染、炎症时, HDL-c在调整全身炎症的过程中,以上功能发生改变,成为“功能不全”的“炎症前高密度胆固醇”的状态,它有助于血管粥样斑块的氧化和炎变[17]。表达Dhcr24转基因阳性鼠的左心室壁变厚,心室腔变小,每分钟心输出量和射血分数都比野生型同龄小鼠有明显提高[18],这可能与 HDL-c的增加有着必然的联系。

综上所述,我们已经成功建立了全身表达的Dhcr24转基因小鼠模型,并证实 Dhcr24基因对雌性小鼠的体重和血生化指标,包括 LDH,TP,Alb, SCr,HDL-c和ALP具有明显的影响,而 Dhcr24转基因雄鼠在体重和血生化指标上没有明显的变化。这种 Dhcr24转基因小鼠的性别差异性与报道DHCR24转基因小鼠的性别特异性自主活动和应激反应[19]结论一致。这为进一步研究该基因在心血管疾病的作用机制提供了重要的动物模型。

[1] Porter JA,Young KE,Beachy PA.Cholesterol modification of hedgehog signaling proteins in animal development[J].Science, 1996,274:255-259.

[2] Fielding CJ,Fielding PE.Cholesterol and caveolae:structural and functional relationships[J].Biochim Biophys Acta,2000, 1529:210-222.

[3] Galbiati F,RazaniB,LisantiMP.Emerging themes in lipid rafts and caveolae[J].Cell,2001,106:403-411.

[4] CrameriA,Biondi E,Kuehrile K,et a1.The role of seladin.1, DHCR24 in cholesterol biosynthesis.APP processing and Abeta generation in vivo[J].EMBO J,2006,25(2):432-443.

[5] Lin AE,Ardinger HH,Ardinger RH,et a1.Cardiovascular malformations in Smith Lemli-Opitz syndrome[J].Am J Med Genet,1997,68:270-278.

[6] SarkarD, Imai T,Kambe F,et al.The human homolog of Diminuto/Dwarf1 gene(hDiminuto):a novel ACTH-responsive gene overexpressed in benign cortisolproducing adrenocortical adenomas[J].Clin EndocrinolMetab,2001,86:5130-5137.

[7] Revollo JR,Grimm AA, Imai S.The NAD biosynthesis pathway mediated by nicotinamide phosphoribosy transferase Regulates Sir2 Activity in mammalian cells[J].J Biol Cher m,2004,279 (49):50754-50763.

[8] Gordan JW,Ruddle FH. Integrationand stablegerm line transmission of genes injected into mouse pronuclei[J]. Science,1981,214(4526):1244-1246.

[9] 高绍华.血清LDH、HBDH水平与急性白血病患者临床转归的关系[J].武警医学院学报,2009,18(04):341.

[10] 马虹宇.许斌雌激素与孕激素对雌性大鼠且于组织碱性磷酸酶活性的影响[J].伤残医学杂志,1996.4(4):1.

[11] 马虹宇,孙海鹰,孙丽芳.雌激素对大鼠心肌组织 CK、LDH及AST活性的影响[J].哈尔滨医科大学学报,2001,35(2): 143.

[12] 曹宇行,石湘芸,关淑珍.冠心病、高血压病人血脂与载脂蛋的临床研究[J].解放军预防医学杂志,1996,21(5):367.

[13] 康格非.床生物化学和生物化学检验[M].北京:人民卫生出版社,1998:16—25.

[14] 陈福刁.间歇低氧运动对大鼠血清总蛋白和白蛋白的影响[J].韩山师范学院,报,2006,27(3):75-76.

[15] 韩家如.解读肾脏功能检查[J/OL].中国保健,[2009-8-30].http://zgbj.qikan.com/ArticleView.aspx? titleid = zgbj20070534

[16] 王贵强.肝脏酶生化检测的临床评价[J].中国实用内科杂志,2002,22(1):5356.

[17] 王鸿利.实验诊断学[M].北京:人民卫生出版社,2001:172 -176.

[18] 宋铭晶,董伟,全雄志,等.心脏特异表达Dhcr24转基因小鼠的建立和表型分析 [J].中国比较医学杂志,2008,18 (5):1-4.

[19] 梁虹,宋铭晶,施海霞,等.DHCR24转基因小鼠的性别特异性自主活动和应激反应 [J].中国现代医药杂志.2009, 1:1-5.

The Effect of Dhcr24 on Blood Chem istry in the Dhcr24 Transgen ic M ouse

QUAN Xiong-zhi,DONGWei,CAO Xing-shui,ZHANGLian-feng
(KeyLaboratory of Human Diseases ComparativeMedicine,Ministry of Health;Institute ofLaboratoryAnimal Science,Chinese Academy ofMedical Sciences(CAMS)&ComparativeMedicine Centre,PekingUnionMedical Collage(PUMC),Beijing 100021,China)

ObjectiveTo establish the transgenic mouse of 24-dehydrocholesterol reductase gene(Dhcr24)to study the effect ofDhcr24 on metabolis m in vivo.M ethod The mouse Dhcr24 was clone by RT-PCR and the sequence of the cDNA was confirmed by sequence analysis.The transgenic plasmidwas constructed by inserting the Dhcr24 gene in the downstream of CMV promoter.The transgenic mice were generated bymicroinjection method and the genotype was detected by PCR.The expression levels of the gene were deter mined with RT-PCR andWestern Blot.The blood biochemistry items were detected with a Photometer Reflotron Plus for blood following clinical procedure.Result Two transgenic C57BL/6J lines of Dhcr24 gene with different expression levels were established.The expression of the Dhcr24 gene was obviously detected in the liver and spleen.The transgenic mice showed obviously decreased levels of weight,lactic dehydrogenase (LDH),total protein(TP),Albumin(Alb)and serum creatinine(SCr)comparedwith thatof thewild type mice,whilethe increased high-density lipoprotein cholesterol and increased alkaline phosphatase(ALP)were detected in the transgenic mice。ConclusionThe DHCR24 transgenic mice were established successfully and indicated the Dhcr24 gene regulated bodyweight of the female mice and the blood chemistry included the levels of LDH,TP,Alb,SCr,HDL-c and ALP of female mice.

Dhcr24;Transgenic mouse;Blood chemistry

R541

A

1671-7856(2010)01-0036-05

2009-09-08

卫生部项目,实验动物和人类疾病动物模型资源扩展(200802036)和十一五新药专项支持(2009ZX09501-026)。

全雄志,研究实习员。

张连峰。E-mail:zhanglf@mail.cnilas.org