张志宏,孙 博,金艺鹏,林德贵

(中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193)

马拉色菌属为人类及温血动物体表正常菌群之一,也是条件致病菌。该菌分为7种,对于人类来说糠秕马拉色是花斑癣、脂溢性皮炎的主要病原。犬马拉色菌性外耳炎是犬临床常见的一种外耳道疾病,由于犬外耳道的特殊构造、耳毛多、外耳道耵聍腺、脂肪腺分泌的异常,加之内外环境的改变而使原本是常驻菌的马拉色菌发生过度生长,造成马拉色菌性外耳炎。从上世纪起,抑制马拉色菌的药物研究主要是以抗真菌剂如酮康唑、氟康唑为主。中药以其不易产生耐药性、低毒低副作用的特点越来越引起各国真菌学者的重视。本试验选取17种具有明显抑制真菌作用的中药的活性成分对犬外耳炎分离的4种马拉色菌进行体外药敏试验,同时以临床常用抗真菌药氟康唑做为对照,观察抑菌效果,筛选出效果较好的中药活性成分,为马拉色菌相关疾病药物治疗提供新帮助。

1 材料与方法

1.1 菌株 北京观赏动物医院2007年1～12月的犬外耳炎化验中,在Leeming&Notman培养基初步分离出马拉色菌,又经过SDA生长试验、过氧化氢酶试验、七叶苷利用试验以及在不同吐温上的生长试验,最终鉴定出4个马拉色菌菌种,其中厚皮马拉色菌16株,合轴马拉色菌11株,限制马拉色菌3株,钝形马拉色菌2株。

1.2 供试药物 肉桂醛、柠檬醛、土槿皮乙酸、厚朴酚、麝香草酚、盐酸小檗碱、丁香酚、大黄酚、肉桂酸、丹皮酚、丹参酮 II、黄芩苷、白藜芦醇、莪术醇、儿茶素、苦参碱、酮康唑、氟康唑、盐酸特比萘芬等标准品均购自中国药品生物制品检定所。

1.3 方法 本试验参照美国临床和实验室标准委员会(CLSI)制定的M-27A标准进行微量液基稀释法药敏试验。

1.3.1 Leeming&Notman液体培养基制备 蛋白胨1.0 g,葡萄糖1.0 g,牛胆盐 8.0 g,酵母浸膏2.0 g,甘油 1.0 g,吐温-605.0 g,橄榄油 30mL,氯霉素50 mg,加入1000mL蒸馏水混匀,115℃高压灭菌15 min,备用。

1.3.2 菌液制备 取马拉色菌于试验前35℃培养24 h活化,活化2次,使之处于指数生长期后期,挑取少量菌落稀释于灭菌生理盐水中,血细胞计数板计数调整浓度为1×104～5×104CFU/mL,再用Leeming&Notman液体培养基调整至2.5×103±1.0×103CFU/mL。

1.3.3 药液及药敏板配制 将17种中药活性成分和氟康唑、酮康唑、盐酸特比萘芬精确称量后用二甲基亚砜(DMSO)溶解成1×105μg/mL原液备用。96孔细胞培养板,于每排1～11孔分别加入Leeming&Notman液体培养基100μL。原药用培养基稀释100倍于第一孔加入100μL,2～10孔依次倍比稀释。1～11孔加菌悬液100μL,11号孔不加药液作为生长对照,12孔加入Leeming&Notman液体培养基200μL作为空白对照。每株菌每种药物3组平行对照。药敏试验共重复2次。

2 试验结果

MIC值判定:32℃孵育每隔24 h观察记录结果连续观察7 d,肉眼观察与生长对照孔相比明显减少为MIC值。17种中药活性成分对马拉色菌药敏试验结果见表1。

3 讨论

近年来对中药抗真菌方面的研究和报道逐渐增多,国内外对这一课题的重视程度也在与日俱增。在我国传统医学中,很早就有关于应用天然药物及其提取物治疗癣证的记录。本研究根据传统医学临床应用实践及文献记载选取了17种具有抗真菌活性的天然药物的活性成分针对马拉色菌进行体外药敏试验,寻找效果明显物质为临床用药及进一步深入研究提供参考。

本试验对从患外耳炎犬耳道中分离出的马拉色菌进行研究,结果表明,这17种中药活性成分中,对马拉色菌具较强抑制作用的有肉桂醛、柠檬醛和丁香酚。其中尤以肉桂醛抑菌效果最好,但其效果稍逊于酮康唑、氟康唑。由于氟康唑、酮康唑等对马拉色菌仅有抑制作用,极易产生耐药性而失去治疗作用。而肉桂醛等中药活性成分不易产生耐药性,且对马拉色菌有杀灭作用,因此其应用前景十分乐观。有报道称盐酸特比萘芬对皮肤癣菌杀菌力强[2],本试验结果显示其抗马拉色菌的效果一般。而各药物对分离出的4种马拉色菌的药敏结果并无显著差异。

表1 17种中药活性成分对马拉色菌药敏试验结果(微量液基稀释法)

土槿皮乙酸、麝香草酚、苦参碱、儿茶素、莪术醇、胆苦苷、丹皮酚、丹参酮Ⅱ 、大黄酚、白藜芦醇、黄芩苷、肉桂酸对马拉色菌无明显抑制作用。虽然这些中药单体均有文献记载具有抗真菌作用,但本试验中它们的活性成分对马拉色菌的作用效果并不明显。笔者认为其原因可能是由于马拉色菌与其他真菌的种属差异有关。另外药物活性成分与有效成分的差别及中药本身成分的复杂性也是重要的影响因素。

念珠菌对唑类药物有拖尾现象,结果不易判读;而马拉色菌药敏试验无明显的拖尾现象,结果容易判读。目前,对于马拉色菌体外药敏试验还没有标准化方案,特别是中药抗马拉色菌的药敏试验的标准方案和参考标准目前仍是空白。笔者在试验中发现,将CLSI制定的M-27A标准运用到中药活性成分抗马拉色菌试验中,同样具有试验结果易分析、方便、可重复性好等优点,这将有利于抗真菌中药药敏试验标准化,推动中药抗真菌作用研究。

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