成志强 王晓玫 单军 高利昆 许静 彭全洲 胡锦涛

1.深圳市人民医院病理科，广东 深圳 518020 2.深圳市人民医院放射科

MDM2-P53反馈调节对大肠癌作用的临床病理学研究

成志强1王晓玫1单军2高利昆1许静1彭全洲1胡锦涛1

1.深圳市人民医院病理科，广东 深圳 518020 2.深圳市人民医院放射科

目的 分析MDM2基因扩增、P53基因缺失与蛋白异常表达在大肠癌发生演进中的作用、与临床病理因素的关系。方法 应用RT-PCR、FISH和免疫组化技术，检测72例大肠癌组织MDM2基因扩增、p53基因缺失以及其蛋白表达特点。结果 大肠癌MDM2基因扩增、p53基因缺失率为28.1%和53.1%，两蛋白表达阳性率为43.0%和65.0%。MDM2、p53蛋白在肝转移、淋巴结转移组中表达明显增多，与对照组比较差异有显著性(P=0.011)；p53基因缺失、MDM2基因扩增在有静脉侵袭大肠癌组明显高于无静脉侵袭组（60.7%和31.8%），MDM2蛋白表达与癌细胞对静脉侵袭性有关（P =0.016）。 结论 MDM2、p53基因参与大肠癌发生发展过程，MDM2在肝转移组、静脉侵袭组表达明显增多，可作为肝内微小转移的参考指标, MDM2、p53蛋白表达与淋巴结转移、肝转移有明显相关性，提示预后不良，两基因联合检测对大肠癌预后评估有重要意义。

MDM2癌基因；p53抑癌基因；大肠癌；荧光原位杂交； RT-PCR

大肠癌是严重危机人类健康的常见恶性肿瘤之一，近年发病率呈明显上升趋势。虽然治疗技术不断改进，但预后较差，究其原因是患者就诊时已经发展到疾病的中、晚期，肿瘤的高侵袭力与高转移能力是致死的主要原因，探究大肠癌发生发展机制、寻求判断患者预后的有用指标,是国内外学者关注的热点。MDM2是成瘤性很强的新癌基因，位于染色体12q13-14，其蛋白产物p 90能与野生型p 53蛋白结合使其失活或功能抑制，肿瘤细胞逃逸p 53基因对生长调控作用，导致细胞异常增生。MDM2- p 53反馈调节环路在软组织肉瘤、胶质瘤、食道鳞癌和乳腺癌等肿瘤的发展中起重要作用[1-2]，然而对大肠癌组织MDM2基因扩增与表达的研究甚少，对MDM2-p 5 3反馈调节环路对大肠癌致癌机制以及与临床病理因素的关系仍不清楚。

本实验运用RT-PCR、FISH、免疫组化技术检测人大肠癌标本MDM2基因扩增、P53基因缺失与蛋白表达，探讨MDM2、p 5 3基因异常与大肠癌发生发展、肿瘤浸润、转移能力等临床病理因素的关系，试图了解MDM2-p53反馈调节环路在大肠癌发生发展的作用，寻找判定大肠癌患者预后的生物学标志物。

1 材料和方法

1.1 材料 收集我院手术切除大肠癌标本共72例, 标本经40g·L-1甲醛固定，梯度酒精脱水、石蜡包埋制片（表1, 其中32例为术后30分钟内迅速将新鲜大肠癌标本液氮冷冻，并保存于-80℃低温冰箱），进行FISH、免疫组织化学和RT-PCR检测。Path VysisTM p53 DNA Probe Ki t购自美国Vys i s公司，由定位于17p13.1、17p11.1染色体的p53基因和CEP17着丝粒探针组成。单克隆抗体MDM2（鼠抗人, 稀释倍数为1：60，）和p53（鼠抗人DO7，稀释倍数为1:100，）均购自DAKO公司，山羊血清、生物素标记的抗小鼠I g G、抗辣根过氧化物酶标记的链酶素—卵白素复合物及DAB显色液购自Santa Cruz公司。RNA提取试剂盒、引物、RNA酶抑制剂等试剂购自上海生工生物工程公司。MDM2序列为[3]：5′TTATTAAAGTCTGTTGGTGCA3′,5′TGAAGGTTTCTCTTCCTGAAG3′（336bp）;β-actin序列为：5′CTACAATGAGCTGCGTGTGGC3′，5′CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3′（240bp）。

1.2 方法 1.2.1 间期细胞核FISH检测：切片蛋白酶K消化处理、变性、37℃湿盒内杂交，0.3%NP-40/2×SSC和0.1%NP-40/2×SSC溶液73℃和常温下洗脱， DAPI II复染后在Olympus BX60多色荧光显微镜观察并计数荧光信号[4]。每例样本连续观察1 00个肿瘤细胞间期细胞核，计算单个细胞内红色与绿色荧光信号数和比例，当30%以上的细胞群出现某种信号异常，则判定这种异常存在。红色荧光信号数（p53）与绿色荧光信号数（CEP 1 7）的比值作为p 5 3缺失指数（deletion index，DI）。DI值＜1者规定为基因缺失。 1.2.2 免疫组织化学染色：切片常规脱蜡水化，3mL·L-1 H2O2封闭内源性过氧化物酶活性，柠檬酸盐缓冲液(1mL·L-1，PH6.0)微波修复抗原，非免疫山羊血清封闭 (10 Ml·L-1)，Ⅰ抗室温孵育1h，滴加Ⅱ抗、 ABC复合液分别孵育30mi n，DAB-H2O2显色，苏木素复染、封片。PBS(0.01mo l·L-1)替代I抗作为阴性对照，用已知阳性片作阳性对照。MDM2和p 5 3阳性表达者均为肿瘤细胞核着色（深棕色或棕黄色），细胞质和胞膜不着色(有时MDM2染色可见个别细胞质或/和胞膜呈浅黄色着色)。随机计数1000个肿瘤细胞，阳性细胞所占该病变百分比区分：肿瘤细胞阳性数≤5%为阴性，＞6%为阳性。1.2.3 RT-PCR半定量分析：按照试剂盒说明抽提组织总RNA，反转录合成c DNA, 检测c DNA浓度与纯度, PCR反应条件为94℃预变性（2min）、93℃(40sec)、55℃ (35sec)、72℃(30sec)，经35个循环72℃延伸10mi n后琼脂糖凝胶电泳（2%），对PCR电泳条带进行定量分析。β-actin作为内参照。参考Bueso Ramos 标准，MDM2指数＝MDM2:β-actin ，以正常大肠黏膜作为对照，当大肠癌MDM2指数是正常对照的2倍以上时，规定为MDM2基因扩增[5]。 1.2.4 统计学分析 采用SPSS 13.0软件分析，定性资料采用χ2检验，P＜0.05时有显著性差异。

表1 肝转移与大肠癌诸临床病理参数关系

表2 大肠癌MDM2、p 5 3基因蛋白表达与临床病理参数分析

表3 MDM2基因扩增、p 5 3基因缺失与大肠癌侵袭能力、细胞分化的关系

2 结 果

2.1 大肠癌肝转移与诸临床病理参数关系将大肠癌为分两组（肝转移组与非肝转移组）分析与临床病理参数的关系发现：年龄、性别、部位和肿瘤大小与肝转移未见相关性，癌组织浸润深度、淋巴管侵袭、静脉侵袭、淋巴结转移与肝转移间呈现正相关（P＜0.05，表1)

2.2 MDM2和p 5 3蛋白表达与临床病理因素关系 MDM2、p 53蛋白表达与性别、部位、癌肿最大直径、肿瘤分化程度、癌细胞浸润深度、淋巴管侵犯间未见相关性，MDM2、p 5 3蛋白表达在淋巴结转移组明显高于不伴淋巴结转移的大肠癌组（图1－2），差异有显著性（χ2=6.533，P=0.011和χ2=5.678，P=0.017）；有静脉侵犯组MDM2蛋白表达明显高于无静脉侵袭组( 60.7% vs 31.8% ), 两者间差异有显著的统计学意义（χ2= 38.178，P =0.000，表2）。

图1 免疫组织化学染色 P53基因蛋白在大肠癌组织的表达, 阳性者为肿瘤细胞核呈深棕色着色（ABC法，×200） 图2 免疫组织化学染色MDM2基因蛋白在大肠癌组织的表达, 阳性者为肿瘤细胞核呈深棕色着色（ABC法，×200） 图 3 P53基因FISH检测 本病例DI＜1 为P53基因缺失。图中可见大肠癌细胞内有2个绿色荧光信号（17号染色体）和1个红色荧光信号（×1000） 图 4 大肠癌MDM2 RT-PCR半定量分析 M：Mar ker；1：阴性对照；2-4：MDM2 有基因扩增；5-7:未见MDM2基因扩增

2.3 MDM2基因扩增、 p53基因缺失与大肠癌侵袭能力/细胞分化的关系 随机抽取32例大肠癌标本进行了RT-PCR和FISH检测，大肠癌组织p53基因缺失率为53.1%，有静脉侵袭组p53 DI值＜1者占66.7%（图3），比无静脉侵袭组基因缺失率明显增高（4 7.8%）。检测MDM2 基因扩增情况显示： MDM2 基因扩增率为28.1%（表3，图4），比较扩增率与癌细胞分化程度的关系，分化好的大肠癌比分化差者MDM2 基因扩增频率明显增加（16.7%和42.9%）；有静脉侵犯、淋巴结转移的大肠癌MDM2基因扩增率亦明显高于无静脉侵犯、无淋巴结转移病例（表3）。因用于MDM2基因扩增与P53基因缺失检测的样本量偏少, 经Fisher’s精确检验后未发现有统计学意义，今后将扩大样本量进一步研究。

研究发现， MDM2基因蛋白表达阳性有31例，其中p53亦表达阳性有23例（74.2%），p53基因无表达者有8例（25.4%）； 在MDM2基因无表达者41个病例中, 33.3%（24例）病例p53表达阳性，MDM2与p53基因均无表达者有17例（23.6%），有部分病例MDM2基因扩增而蛋白表达无表达，部分病例p 53蛋白表达阳性，但未检测到p53基因缺失。

3 讨 论

Vogelstein继 “大肠癌多阶段发生发展”学说发表后，2000年提出 “p53基因网络”假说，p 5 3基因与上、下游功能相关基因组成了一个复杂的基因网络，p 5 3基因是联系着不同遗传应急和细胞应答的中间环节。p 5 3基因通过空间构象的改变，失去对细胞、凋亡和DNA修复的调节作用，转变成癌基因[6-8]。p 5 3基因突变后诱导MDM2基因转录表达P90蛋白，形成P90- p53复合物使野生型p53失活。MDM2主要通过抑制p53基因转录活性、介导p 53的降解，实现对p 53功能的调节作用。MDM 2癌基因具有较强的成瘤性，本身可使细胞转化，MDM2是p 5 3的转录靶基因，在野生型p53基因的诱导下转录表达增强，使细胞内MDM2蛋白水平升高，转而与p 53结合形成复合物，抑制p53的转录活性，MDM2- p53反馈调节环路在肿瘤发生发展中起着重要作用[8-9]。

在对软组织肉瘤、头颈鳞癌、食道鳞癌和乳腺癌等的研究中，发现有MDM2蛋白表达或扩增与肿瘤复发、转移密切相关[10-11]。大肠癌虽然是消化道恶性肿瘤中手术治疗效果较好的肿瘤，但影响预后的最大因素仍然是转移。随着对治疗方案的不断改进，预防肝转移、淋巴结转移成为亟待解决的问题。本实验从mRNA、DNA和蛋白水平探讨了MDM2基因、p 5 3基因异常与大肠癌的关系，了解MDM2-p53反馈调节环路对大肠癌作用机制。本研究发现：大肠癌各阶段均可检测到MDM2蛋白表达（43.0%）和基因扩增（28.1%），MDM2扩增率在分化差的癌组织中表现增强，提示MDM2可能与肿瘤细胞分化程度有关。MDM2蛋白表达率为43.0%，基因扩增频率为27.1%，可见MDM 2蛋白过度表达主要不是由于基因扩增，推测与转录增加有关。有静脉侵袭、肝转移的大肠癌组织MDM2基因高表达，推测MDM2基因在血行转移尤其是在肝转移判断中有重要价值(P＜0.05)，与Adachi等对脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤的研究结果相似[12-14]。提示可作为判断大肠癌患者静脉侵袭、肝转移等预后的生物学指标。

应用FISH和免疫组化技术检测，发现p53基因缺失率53.1%，蛋白表达率为65.2%，p53基因异常与细胞增恶、侵袭性、转移能力有关，符合“结直肠腺瘤-癌”的顺序发生机理， 说明p53基因缺失、突变与大肠癌发生发展密切相关，是大肠癌致癌机制中重要的基因改变。 MDM2蛋白与p53蛋白表达有一定相关性， MDM2蛋白与p53蛋白高表达常常同时出现，两者均阳性表达病例为74.2%，提示MDM2和p53基因参与大肠癌发生发展过程，MDM2-P53反馈机制是大肠癌细胞生长调控中的一个重要因素，在肿瘤发生和恶化过程中起重要作用。仅有少数病例MDM2蛋白表达和/或基因扩增而p 53基因表达缺失，可能是MDM2基因本身所具的成瘤性，或有其它机制在大肠癌演进中起主导作用，尚需增加标本量进一步深入研究。

统计分析表明，MDM2和p 5 3蛋白共同表达、MDM2基因扩增和p 5 3蛋白表达两者共同存在时，肝转移、淋巴结转移占多数，提示与预后不良有关，与国外文献报道相符[15-16]。本研究发现MDM2和p53基因异常与患者性别、肿瘤大小、部位和癌细胞浸润肠壁深度未见相关性（P＞0.05）。 综上所述，MDM2基因异常是大肠癌发生发展中较为常见的分子变化，它可能是除 p53基因突变以外导致大肠癌野生型p 53功能丧失的又一重要原因。MDM2在肝转移组、静脉侵袭组表达明显增多，可作为判断静脉侵袭性和肝内微小转移的参考指标；MDM2基因、p 5 3基因表达与淋巴结转移、肝转移有明显正相关，提示两基因与肿瘤细胞的侵袭性、转移能力密切相关，联合检测对大肠癌预后评估有重要意义。

1.Gunther T, Schneider-Stock R Hackel C, et al.MDM2 gene amplification in gastric cancer correlation with expression of MDM2 protein and P53 al terations Mod Pathol, 2000,13(6):621-626.

2.Takaomi Koga, Shuichi Hashimoto, Kenji Sugio, Heterogeneous distribution of P53 immunoreactivity in human lung adenocarcinoma correlates with MDM2 protein expression,rather than with P53 gene mutation.Internation J Cancer.2001；95 ： 232-239

3.宋士群 黎庶 乳腺癌的X线征象与免疫组化标记物相关性研究中国CT和MRI杂志[J]2008 6(6)

4.王晓玫，单军，左敏，苏学劲，王玲，陈灼怀.应用FISH技术检测原发性肺癌P53抑癌基因异常及其临床意义.中国误诊学杂志 2002；6：829～32。

5.Bueso-Ramos CE, Yang Y, Deleon E.the human MDM2 oncogeneis overexpressed in leukemias.Blood; 1993；82：2617-2623.

6.王晓玫，单军，苏学劲，王玲，左敏.结肠异时性腺瘤中Bcl-2和P53异常表达的临床病理研究 中国误诊学杂志 2002; 2:985-987.

7.Nasir L, Rutteman GR, Reid SW, Schulze C, Analysis of p53 mutational events and MDM2 amplification in canine sof ttissue sarcomas.Cancer Lett.2001；174：83-9

8.Gareth L, Wenwei Hu, Elisabeth E,Harlan Robins, Stuart G.A Single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the P53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans.Cel l.2004; 119: 591-602

9.王晓玫，成志强，陶凤华，苏学劲，王玲.应用SSCP-PCR技术研究非小细胞肺癌P53基因突变.第四军医大学学报 2003；24：1650－1652

10.Gunther T, Schneider Stock R, Rys J.P53 gene mutations and expression of P53 and MDM2 proteins in invasive breast carcinoma: A comparative analysis with clinico-pathological factors.Cancer Res Clin Oncol, 1997; 123:388-394.

11.Arora S, Mathew R, Mathur M, Chattopadhayay TK, Ralhan R.Al terations in MDM2 expression in esophageal squamous cel l carcinoma: relationship with p53 status［J].Pathol Oncol Res 2001,7(3):203-8

12.The p53 and Mdm2 families in cancer.Br J Cancer 2001; 85:1813-23.

13.Mil lon R, Mul ler D, Schultz I, Loss of MDM2 expression in human head and neck squamous cel l carcinomas and clinical significance［J].Oral Oncol［J].2001 Dec;37(8):620-31

14.Adachi T, Oda Y, Sakamoto A, Immunoreactivity of p53,mdm2, and p21WAF1 in dedif ferentiated liposarcoma: special emphasis on the distinct immunophenotype of the wel ldif ferentiated component［J].Int J Surg Pathol.2001；9：99-109.

15.Knights CD, Liu Y, Appel la E.Defective P53 posttranslationslationl modification required for wild-type P53 inactivation in malignant epithelial cel ls with mdm2 gene amplification.J Biol Chem,2003;289:52890-900.

16.Thomas G, Regine SS, Carsten H, Hans_Udo K, Matthias P.MDM2 gene amplification in gastric cancer correlation with expression of MDM2 protein and P53 alterations.Mod Pathol 200; 13: 621-626.

A clinicopathological study of the Relationship of MDM2 and P53 gene with biological behavior in colorectal carcinoma

CHENG Zhi-qiang1, WANG Xiao-mei1，SHAN Jun2，et al.Depar tment of Pathology1and Depar tment of Radiology2, Shenzhen People’s Hospital .Shenzhen, 518020, China.

ObjectiveTo investigate the relationship of MDM2 gene, P53 gene with clinicopathologic parameters in colorectal carcinoma.MethodsThe detection of MDM2 amplification, p53 deletion and their protein in 72 patients by RT-PCR, FISH and immunohistochemical technique.Resu l t s The ratio of MDM2 and P53 gene expression in the group of the colorectal carcinoma was 28.1% and 53.1%, but protein expression was 43.0% and 65.0%,respectively.Expression of MDM2 and p53 protein was higher in the groups of lymph node metastasis than nometastasis,their dif ference had significant in statistics (P =0.011); expression of MDM2 between the groups of venous invasion(60.7%) and noinvasion(31.8%) was also shown evident ly dif ference (P =0.016).Conclusions MDM2-P53 pathway is a part of the carcinogensis of the colorectal carcinoma.The relationships of the expression of MDM2 gene and p53 gene were significantly detected with the liver metastasis, with lymph node metastasis and with venous invasion in colorectal carcinoma.MDM2 gene amplification was demonstrated and associated the relationship with venous invasion and liver metastasis significantly.This study suggests that the expression of MDM2 and p53 gene seem to be greater value as a biomarker of liver metastasis, lymph node metastasis and venous invasion in colorectal carcinoma.

MDM2 gene; p53 gene; colorectal carcinoma; FISH; RT-PCR

R735.34

A

10.3969/j.issn.1009-3257.2010.04.001

王晓玫

2010-06-03