魏明 田临红 程义新

HIV/AIDS实验室检测进展

魏明 田临红 程义新

获得性免疫缺乏综合征;临床实验室技术;进展

获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome)简称艾滋病(AIDS),是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,H IV)感染所引起的一种严重的传染性疾病。实验室检测一直是诊断 HIV/AIDS的主要依据。自1985年第一代 HIV抗体问世以来,HIV病原学检测方法有了长足的进步。各种检测 HIV的新技术层出不穷,实验室检测方法也在不断提高和更新。本文就近年来 HIV/AIDS实验室检测的研究进展综述如下。

1 HIV的结构特点

H IV呈球形或卵形,直径 90～130nm,包膜由病毒特有的蛋白质附着于一薄层类脂质构成。其核心含有两条相同拷贝的 RNA链,其外周是由多种蛋白质形成的核膜。HIV同其他逆转录病毒一样,基因组中存在三个大的开放读框,其顺序是gagpolenv.Gag基因编码 55 kD的前体蛋白,在病毒成熟过程中,被 pol基因编码的蛋白酶加工,分别产生核心蛋白 P17,核壳蛋白 P24和核酸结合蛋白 P15。P24是核壳组成蛋白,构成病毒的核衣壳,它的结构比较稳定,是 HIV-1型的特异性蛋白。在 H IV-2与 P24对应的是主要核心抗原 P32,为 HIV-2型病毒感染的特异标志。Env编码包膜蛋白,由外膜糖蛋白 gp120和跨膜糖蛋白 gp41组成 (在 HIV-2型病毒中与之相当的是gp110/130和 gp36)[1]。CD4是 HIV最重要的靶细胞,在 CD4淋巴细胞内反转录酶将 RNA逆转录成前病毒DNA,接着整合到宿主细胞基因组 DNA中,而后和细胞一起复制。

2 HIV抗体检测

迄今为止,血清学实验依然是 HIV实验室诊断的主要依据[2]。血清学实验即H IV抗体检测,是 HIV感染诊断的常规方法,分为初筛实验和确认实验两个步骤。

2.1 初筛实验 包括酶联免疫吸附实验(ELISA)、快速检测(RT)实验、尿液 HIV抗体检测等。常用的初筛实验是酶联免疫吸附实验(ELISA),ELISA试剂在经过了第 1代、第 2代、第3代后,已经发展到第 4代检测试剂[3]。1985年,美国 FDA批准使用第 1代ELISA检测试剂,第1代试剂主要以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板,以检测血清中的抗体。由于包被的抗原不很纯,假阳性率较高,结果不令人满意。1990年,第 2代试剂应运而生,第 2代试剂使用了基因工程的重组或人工合成多肽 HIV抗原包被反应板,抗原组成一般包括P24、gp 36、gp41、gp120,能同时检测 HIV-1,HIV-2型,其特异性较第 1代试剂有了很大的提高。1992年美国研究出第 3代试剂,使用双抗原夹心法检测抗体,进一步提高了敏感性;另外,由于第 3代试剂能同时检出 IgM抗体,因此可以缩短窗口期,但仍存在漏检的问题。第 4代试剂,则在第 3代的基础上进一步增加了 P24抗原的检测,把H IV抗原和抗 P24的抗体同时包被反应板,同时检测血清中的 HIV抗体和 P24抗原,进一步缩短“窗口期”。与第 3代试剂相比,第 4代试剂检测窗口期平均缩短 4～5 d。

2.2 确认试验 包括免疫印迹试验(WB)、条带免疫试验(LIATEK H IVⅢ)、放射免疫沉淀试验(RIPA)及免疫荧光试验(IFA)。国内常用的确认试验方法是 WB,其中最早出现的条带是 P24或 gp 160。WB有直接使用病毒裂解物作为抗原的,也有使用重组抗原和合成肽的。HIV特异性抗体检测 EIA(高敏感性),加上 WB(高特异性),诊断的准确率 ＞99%,假阳性率约为 0.0006%,造成错误诊断的机会几乎是“0”[4]。

3 P24抗原检测

机体感染 HIV后,P24抗原是较早能从血清中检出的病原学标志,感染后 2～3周即可检出,1～2个月左右进入抗原高峰,然后随着抗体的产生形成抗原抗体复合物,由于抗体的中和作用,P24抗原浓度下降至难以测出的水平。进入无症状期,HIV抗体持续阳性。从机体感染 HV到产生相应抗体的这段时间叫窗口期,一般 1～9个月,平均 2～3个月,但 95%以上HIV-1感染者产生抗体的时间是在感染后 6个月以内[5]。抗原在血清抗体阳转前 2～18 d即可检测到,H IVP24抗原检测主要是作为 HIV抗体检测窗口期的辅助诊断。通常采用夹心法EIA,即将纯化的已知抗体包被在固相反应板孔底,当加入待测血清后,若血清中含有 P24抗原则与包被抗体形成抗原-抗体复合物。再加入酶(HRP)标记的HIV抗体,在抗原上又结合了酶标记的抗体,加底物显色后,在酶标仪上读结果。近年来为了提高检测血清中 P24抗原的敏感性,将血清中免疫复合物解离(ICD)后再进行测定,发展了 ICDP24抗原测定试剂,用于H IVP24抗原测定。

4 HIV核酸检测

H IV核酸检测有定性和定量 2类,前者用于HIV感染的辅助诊断,后者常用于监测HIV感染者的病程进展和抗病毒治疗效果。HIV核酸定性检测通常使用 PCR或逆转录 PCR(RTPCR)技术,使用分子生物学实验室通用的基因扩增试剂,引物可来自文献或自行设计,应尽量涵盖所有的或常见的毒株,也可使用复合引物。H IV RNA定量测定(病毒载量测定)方法有逆转录 PCR试验(RT-PCR)、核酸序列扩增试验(NASBA)、分枝 DNA杂交试验(bDNA)和荧光实时 PCR技术等。

最近,荧光实时定量 PCR(FQ-PCR)检测技术的应用使PCR的发展进入到一个新境界。传统的 PCR是扩增后进行终点(end point)检测,而荧光实时 PCR则可以进行实时(real time)检测,改变了传统的电泳终点检测,可以进行实时监控,得到相应的 S型扩增曲线。不但可以进行定性检测,更重要是可以进行定量检测,样品中待测DNA/RNA拷贝数越高,则 S型扩增曲线出现越早,若有已知拷贝数的标准品,则可以得到未知样品的拷贝数。美国 PE公司于 1996年发明 Taqman技术,已广泛应用于基因检测。荧光实时 PCR检测技术的应用,使得血浆病毒载量的测定方法在原来的 RT-PCR、分支DNA技术(bDNA)、核酸序列扩增系统(NASPA)基础上,又增加了一种新的方法。该方法可以检测血浆病毒载量,也可以检测血液中单个核细胞的前病毒载量。一般来说,前病毒载量与血浆病毒载量是平行的,具有相关性[6]。但是,经过高效抗逆转录病毒高效抗逆转录病毒疗法(HAART)治疗后,血浆病毒载量可能检测不到,前病毒载量依然可以检测到。前病毒载量,也应该成为一个评价 HAART的指标。

5 CD4+和CD8+T淋巴细胞检测

计数CD4+和CD8+T淋巴细胞的数量,是以细胞内P24抗原作为标志,运用流式细胞仪对 P24抗原阳性细胞进行计数。在T淋巴细胞分类中,CD4+代表T辅助细胞,CD8+代表抑制细胞和 T杀伤细胞。HIV感染人体后的主要靶细胞是CD4淋巴细胞(也累及其他细胞)。随着病情的演变,HIV复制加快,尤其在AIDS临床阶段,其在淋巴结中每天复制可达 100亿左右,且大量释放到血循环中,使更多的免疫细胞与其他细胞被感染,引起每天破坏的细胞数以百万统计。大量细胞的破坏,使CD4淋巴细胞数急剧下降,使免疫系统严重被破坏。一般认为在疾病早期 CD4淋巴细胞 ＞0.5×109/L,中期为(0.2～0.5)×109/L,晚期则为(0.05～0.2)×109/L,而临终期可 ＜0.05×109/L。尽管CD4淋巴细胞数不一定能和病毒载量相吻合,但确实是估计病情、预后,以及开始治疗的指征之一。在测定CD4淋巴细胞时,一般同时测定CD8淋巴细胞,一方面可以了解 CD8淋巴细胞的变化情况,另一方面两者的比值也是很重要的疾病严重程度的指标。CD4/CD8比例通常为 2∶1,但变化很大(1∶1～3∶1)。若比值 ＜1则意味着免疫状况不佳,比值越低,则细胞免疫缺陷越重。

6 HIV细胞培养

常规方法是将患者淋巴细胞与正常人的淋巴细胞共同培养,适当周期培养后测定培养液H IVP24抗原/RT,进而判断患者的淋巴细胞是否受到 HIV感染。细胞培养与血清学方法相比,专一性很强,不会出现假阳性。但其敏感性不如血清学或PCR,因为必须有一定数量的感染细胞存在才能培养出病毒来。培养初期,随着活化细胞(CD25细胞)的迅速增加,此时被H IV感染的活化T细胞也迅速增殖并复制出大量病毒;培养末期,随着细胞抗病毒能力的增强(包括细胞的杀伤作用和对抗H IV感染能力的增强)和感染细胞的衰减,血清中病毒载量逐渐降低,可根据这一特点进行培养和增殖毒种。细胞培养方法的最大好处是能得到最原始的临床毒种,其重要意义在于确认对WB不确定的疑感染者及母婴传播、婴幼儿HIV感染者。毒株可供药物筛选,耐药性及其生物学特性等研究。用定量细胞培养法可测定细胞的半数感染单位(TCID50)和半数抑制药物浓度(IC50),用于抗病毒药物测定。

体外大量扩增基础 CD 4/CD 8比值较高的HIV感染者外周血单个核细胞(PBMC)也是可行的,扩增的细胞具备较强的Th1细胞免疫反应能力,在培养晚期具有较弱的 HIV复制能力,这将为艾滋病的免疫细胞治疗提供必要的实验数据,为进一步开展临床实验奠定基础[7]。

7 基因芯片技术的应用

基因芯片技术是近些年发展起来的新兴的生物技术,是指将许多特定的寡核苷酸片段作为探针,有规律地排列于固相支持物上,然后与待测的标记样品的基因进行杂交,再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描,并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测,从而迅速得出所要的信息。目前基因芯片的发展包括以下几个方面：(1)60～70mer Oligo芯片的应用推广：研究发现,70mer左右长度的单链 DNA片段可以最优化地反映其所代表的基因[8];(2)SNP(Single Nucleotide Polymorphism)芯片的研制：SNP即单核苷酸多态性,指基因组中微小的基因序列差异.SNP谱不仅可用于更精确的个体识别,而且可用于个体疾病易感性的检测[9];(3)mCGH的应用：CGH即比较基因组杂交,虽然是一个传统技术,其与 DNA芯片技术结合可形成基因芯片-CGH(microarray,CGH,mCGH)技术,由于可高通量地比对基因组的结构和组成,在肿瘤、新药研究、药物敏感性以及新疗法的开拓中已开始发挥着重要的作用[10];(4)基因表达谱研究：基因表达谱 (gene expression p ro file)研究可以高通量地检测基因表达信息[11];(5)疾病诊断用基因芯片。

基因芯片技术以其高通量、快速检测的特点,在基因表达、肿瘤诊断、遗传病诊断、基因分型等诸多领域得以广泛应用。在 HIV检测方面,Affymetrix公司开发出 Gene Chip HIV PRT 440芯片,用于抗H IV逆转录酶和蛋白酶药物的耐药性分析。对B亚型的检测结果很好,但对非B亚型的耐药性检测存在漏检和错检。

虽然基因芯片技术尚需要进一步完善,但是可以预见,在未来的几年里,其应用前景是好的。其不仅可用于HIV的耐药性检测和的基因诊断,甚至可以把许多致病病原体的基因集中在一张芯片上,用一张小小的芯片就可以同时对许多微生物的感染进行诊断,这不久将成为现实[2]。

综上所述,本文从抗体、抗原、病毒、T细胞计数、细胞培养及基因芯片技术等综述了 H IV/AIDS实验室检测研究进展。随着分子生物技术的飞速发展,基因芯片技术的应用,HIV/AIDS的实验室检测正朝着快速、敏感、准确、自动化方向发展。相信不久的将来,会有更多的新技术被应用到这一领域。

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5 约翰 G,巴特利特,乔尔 E,等主编.邵一鸣,蒋岩,栾文民,译.艾滋病病毒感染的诊断与治疗.第 1版.北京：科学出版社,2002.1-23.

6 O'Doherty U,Swiggard WJ,Jeyakumar D,et al.Detection early for A IDS infection.JVifol,2002,76：10942-10950.

7 张政,赵敏,聂为民,等.人类免疫缺陷病毒-1感染者外周血单个核细胞体外培养的免疫学及病毒学特点.中华医学杂志,2005,85：1039.

8 Wei M,Ma WL,Zhang B.Oligonucleotide rnicroarray with RD-PCR labeling technique for detection and typing ofhuman papillomavirus.Curr Microbiol,2006,52：204-209.

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10 U rzua U,Frankenberger C,Gangi L,et al.M icroarray comparativegenomic hybridization profile of amurinemodel for epithelial ovarian cancer reveals genom ic im balances resembling human ovarian carcinomas.Tumour Biol,2005,26：236.

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