王倩如

(南京市妇幼保健院,江苏南京 210004)

毛细管电色谱 (capillary electrochromatography,CEC)是近年来发展十分迅速的一种新型分离技术。它是将常规色谱填料填充到毛细管中,或在毛细管内表面键合、涂敷固定相,以电渗流(EOF)作为流动相的推动力,根据样品中各组分在固定相和流动相间分配系数的差异和在电场中迁移速率的不同而实现分离的一种高效微分离技术。近年来,随着 CEC柱制备技术、分离机制、仪器设备的不断研究和发展,CEC已在分析领域中引起广泛关注,并在有机小分子分离、环境分析、药物分析和生化分析等方面得到应用。本文就 CEC的研究进展、CEC整体柱制备新进展及其在药物分析中的应用作一概述。

1 研究进展

毛细管电色谱的发展可追溯到20世纪50年代,Mould和Synge将电场应用到薄层液相色谱中进行寡糖分离,1974年,Pretorius等[1]首次将电场引入到高效液相色谱中,显示出以电渗流(electroosmotic flow,简称 EOF)作为流动相推动力进行分离的巨大优势,但他们的文章在当时并未引起足够的关注。

1990年,Tusda等人发展了毛细管电色谱连续进样技术,利用柱系统中同时存在的压力流和电渗流对柱内样品进行了富集和分离。1995年,Guo等人首次利用溶胶-凝胶技术制备了开管毛细管电色谱柱。Lord等人发展了毛细管电色谱与质谱联用技术,并将其应用于染料分析中。1998年,Stead等人发展了毛细管电色谱柱上浓缩技术,并用于血浆中甾类化合物的分析。Bayer等人首次实现了毛细管电色谱与核磁共振的联用。次年,Horvath等人进一步发展了毛细管电色谱的动力学理论,对毛细管电色谱和高效液相色谱中影响柱效的各种参数进行了比较研究。Poppe等人研究了填料孔结构对毛细管电色谱柱性能的影响。

近年来,国内外有关 CEC的分离机制、柱制备、应用研究以及全面的综述文章迅速增加,且随着电色谱基本理论的进一步完善,电色谱在生化药物的分析、制药工业、手性药物拆分等领域得到广泛应用。表明在分析领域中已出现毛细管电色谱这一新的研究热点。

2 CEC整体柱制备新进展

毛细管电色谱柱在 CEC分离体系中占据最重要的地位,它具有双重作用：一是作为固定相,承担对分离对象的分离任务;二是在其表面形成双电层,在电场作用下产生电渗流,作为推动力。CEC分离柱主要分为三种类型：填充柱、开管柱和整体柱。由于篇幅所限,本文主要针对 CEC整体柱制备新进展进行介绍。

CEC整体柱可分为有机聚合物型和硅基型两大类。

2.1 聚合物型整体柱

有机聚合物型整体柱是由单体和交联剂在有致孔剂的存在下,在毛细管内由自由基引发原位聚合而得。聚合物型整体柱具有制备简单,重现性好,柱效高及分离快速等优点,已在多种色谱模式下获得了成功的应用。

Ye等[2]采用甲基丙烯酸缩水甘油酯(GM A)和亚乙基二甲基丙烯酸酯(EDM A)聚合制备了中性的聚合物整体柱,然后在聚合物表面修饰了一层胰岛素用于在线消化蛋白质。Dong等[3]借鉴了 Ye等制备聚合物整体柱的方法,采用两性的赖氨酸修饰于柱表面,成功地应用于 CEC分离。这种整体柱的特点在于柱内电渗流方向可以随 pH值的变化而变化,使得分离过程中多了一个调控分离度的参数。

2.2 硅基整体柱

由于 Tanaka研究小组[4]在硅胶整体柱制备方面的出色工作,使得这类整体柱的研究日益受到重视。

Ye等[5]制备了一种苯基氨丙基修饰的硅胶整体柱。他们首先采用 Tanaka研究小组开发的经典制柱技术制备了硅胶整体柱,然后将3一苯基氨丙基三甲氧基硅烷溶液引入柱内,于110℃下反应 lh。与 C18修饰的普通反相柱相比,这种苯基氨丙基修饰的硅胶整体柱在 CEC模式下分离苯胺类的碱性化合物时拖尾很小。

Xie等[6]在制备获得了硅胶整体柱后,采用3-巯基丙基三甲氧基硅烷(3-M PS)修饰整体柱,接着原位键合并氧化巯基为磺酸基团 ,获得了强阳离子交换 (SCX)固定相,用来分离一受体阻滞剂和生物碱取得了210,000至340,000理论塔板 /米的高分离效率。

3 在药物分析中的应用

尽管毛细管电色谱(CEC)技术的发展历史并不长,但作为一个新兴的分离分析技术,其研究和发展的生命力最终必将体现在解决一些实际样品分离分析时所具有的优越性,因此,CEC技术发展到一定的阶段后必定会伴随着大量的实际应用,其结果又将促进 CEC技术的研究和开发。本文将从已有的大量文献报道中筛选出一些比较有代表性的应用实例进行介绍。

3.1 在手性拆分中的应用

CEC进行手性药物对映体拆分主要有三种方式：(1)非手性固定相结合手性添加剂流动相,手性选择作用依靠流动相中添加的手性选择剂产生。(2)手性固定相,固定相上键合手性选择剂,如环糊精、蛋白等。(3)手性分子烙印固定相,进行记忆性、专一性手性分离。Wiedmer等[7]使用 BSA和溶菌酶固定的磷脂涂敷毛细管分离 D型和 L-型色氨酸,L-色氨酸的理论塔板数超过500000m-1,而 D-色氨酸的理论塔板数只用大约22,000m-1,且固定化的 BSA的对映体手性选择性比固定化溶菌酶高。

3.2 CEC在传统中药复杂成分中的应用

随着毛细管电色谱的出现及推广,为中药有效成分的分离分析提供了新方法和新手段。如李海燕等[8]运用胶柬电动毛细管色谱法同时分离测定了水中邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸丁苄酯、邻苯二甲酸二辛酯五种邻苯二甲酸酯的标准混合物。结果表明,30 min内五种邻苯二甲酸酯得到了较好的分离。廖杰等[9]使用反相毛细管电色谱分离蝉翼藤山酮类化合物,并对色谱分离条件进行优化研究。

3.3 CEC在生物大分子中的应用

不少研究工作者开始将研究方向转移到 CEC分离分析生物大分子。如 Bandilla等[10]使用整体柱毛细管电色谱分离模型蛋白,并表明了蛋白质容量因子随流动相中有机溶剂的增加而增加 ,且获得了高分辨率。Lin等[11]使用整体柱毛细管电色谱分离寡肽(包括血管紧张素Ⅰ、血管紧张素Ⅱ、Sar11、Thr8血管紧缩素、催产素、抗利尿激素系、牛 β-酪蛋白的肽能片段、人 β-酪蛋白的肽能片段和 FMRF酰胺),并比较了模板聚合物和无模板聚合物的分离行为,指出这些寡肽的电色谱分离由电泳迁移和色谱保留介导。Asthana等[12]使用胶体聚合(N-异丙基酰胺)颗粒作为假固定相的毛细管电色谱进行 DN A突变分析,指出基于聚合(N-异丙基酰胺)的毛细管电色谱有较窄的大小分布。

3.4 CEC在环境分析中的应用

由于化学合成工业的发展和天然化合物的开发,使得环境污染越来越严重。据报道,被确认为环境污染物的已超过350种。因此,环境污染物的检测和监控已成为分析化学中重要的研究课题之一,CEC技术已开始被应用于环境污染物的分析。如李海燕等[13]采用胶束电动毛细管电泳法同时分离测定了水中邻苯二甲酸二甲酯(DM P)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二辛酯(DOP)五种化合物。并采集实际生产废水样,运用该法测定了其中 BBP的含量。吕海霞等[14]以整体固定相作为分析柱,结合加压毛细管电色谱一紫外检测同时分离马拉硫磷、二嗪农、甲基对硫磷、杀螟硫磷、倍硫磷、甲基毒死蜱和毒死蜱等7种有机磷类化合物。考察了等度洗脱条件下,流动相乙腈配比、缓冲液浓度、酸度及分离电压的影响,建立了最优色谱分离条件。Ye等[15]使用加压毛细管电色谱分离六种合成除虫菊酯农药残留物,且考察了缓冲液PH、有机溶剂含量、缓冲液浓度和应用电压在六种合成除虫菊酯分离上的效应。

4 展望

毛细管电色谱已广泛应用到氨基酸、蛋白质、手性药物、环境样品等多种样品的分析。无论是填充柱、开管柱还是发展势头较快的整体柱,都具有其自身的优势。随着柱制备技术的改进,电色谱柱也将不断地得到完善和发展,电色谱技术必将拥有广阔的应用前景和光明的未来。

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