裴凤群

(平煤医疗集团职业病医院 河南 平顶山 467000)

1 实验材料

1.1 实验药物

浓缩到每mL相当于3.338g生药西红花水提物。获取过程:新疆西红花200g,水2500mL,加热到沸腾,然后提取1.0h,然后对混合液过滤,最后把滤液浓缩提纯到实验所需浓度。

1.2 实验动物

大鼠乳鼠:出生5～7d的Wistar。

1.3 实验试剂

氧化低密度脂蛋白,乙酸乙酯,α-苯基-N-叔丁基氮氧化物。

1.4 实验仪器

超净工作台,MCO-15AC型CO2培养箱,H2S-H型恒温水浴振荡器,LDZ4-0.8型离心机,MK型倒置显微镜,QL-901旋涡混合器,ESR200D-SRC型电子自旋共振波谱仪。

2 实验方法及过程

2.1 培养大鼠原代心肌微血管内皮细胞(rCMEC)

首先进行大鼠的原代培养rCMEC,然后再进行传代培养,传代培养前需先进行rCMEC鉴定,培养出的第三代细胞用于实验[1]。

2.2 实验方法

(1)配制自旋捕获剂PBN:取温浴无菌PBS,把准确称取的PBN放入其中进行溶解,然后把其置于磁力搅拌器上进行搅拌,搅拌时间30min左右,成为200mmol.L-1,PH=7.4的PBN饱和溶液,实验时候把饱和溶液加入到等量的培养基中,最后得到浓度为100mmol.L-1的PBN溶液,作为电子自旋捕获剂。(2)自由基的捕集及内皮细胞培养:把内皮细胞以每孔0.8mL接种于24孔板,密度为1.5×105个/mL,24h细胞贴壁后,把其分为空白对照组、模型对照组、西红花水提物组等6组。各组共同孵育24h。然后,各组均换成100μg.mL-1的ox-LDL的无血清培养基0.25mL,同时将终浓度为100mmol.L-1的PBN0.25mL加入各组,并小心吹打均匀。于37℃时,孵育45min,然后把培养板取出来,用细胞刀,小心刮取细胞,将收集到的细胞悬液置于于5mLEP管中,尽快提取送检[2]。(3)自由基的提取过程把0.4mL乙酸乙酯加入到每个EP管中,混匀。3000rpm,离心10min;把上层无色液体60μL小心吸取到样品管中,放入ESR波谱仪中测定。测定条件:X波段,400G的扫描宽度,3385G的中心磁场,3.2G的调制幅度,20mW的微波功率,增益:4×105,室温下测温。

2.3 数据分析

以均值±标准差形式表示结果,采用方差分析(ANOVA)进行多组间比较,统计学显著性设定P<0.05。

3 结果

用各组谱线第二峰的高度来表示每组细胞自由基与PBN形成的自旋加合物信号的相对强度。实验发现与空白组比较,模型组中自旋加合物信号峰值明显较高,具有显著性差异,而各个西红花给药组信号峰值呈现了不同程度降低,500μg.mL-1和20μg.mL-1信号峰值的降低更为显著。提示西红花水提物能够减少ox-LDL损伤的微血管内皮细胞自由基生成,具有保护内皮细胞免受氧化损伤的作用。

4 讨论

目前,检测自由基最直接和最有效的方法和技术是电子顺磁共振(EPR)也叫电子自旋共振(ESR),但是对自由基的要求较高,首先自由基必须相对稳定,而且要达到一定浓度才能用电子顺磁共振(EPR)技术检测。而实际上,化学反应中及生物体系内产生的自由基大部分是不稳定的,自旋捕集技术则因不受其限制解决了这一技术上的难题。自旋捕集技术就是为了检测和辨认短寿命自由基,将一种不饱和的抗磁性物质加入要研究的反应体系,生成寿命较长的自旋加合物,便于用ESR检测[3]。

鉴于本实验是对细胞中的自由基进行检测,难免受到血清、培养基、温度和氧气等因素的干扰,所以选择 PBN作为本实验的自旋捕集剂比较合适,能相对客观地表现出细胞受到氧化损伤时,氧化应激形成的自由基信号的强弱。本实验发现西红花水提物500μg.mL-1和20μg.mL-1的组细胞悬液中自由基信号明显减弱,即模型组与对照组间有显著性差异(P<0.05),进一步揭示了西红花水提物抗ox-LDL损伤的可能机制。

[1]黄元庆,鲁建华.枸杞总黄酮类化合物抗脂质过氧化研究[J].卫生研究,1999,28(2):115～116.

[2]徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].第3版.北京:人民卫生出版社,2002:1202.

[3]伍静,姚尚龙,杨艳,等.异丙酚对鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤中的保护作用[J].中华麻醉学杂志,2002:112.