张旺信 冯永堂 张秋玲 邓 文 邱玉芳 史献君

(1.泰山医学院，山东 泰安 271016；2.潍坊医学院，山东 潍坊 261053)

脑缺血再灌注是一个十分复杂的病理生理过程，适当的脑保护治疗可以提高缺血脑组织对缺血损伤的耐受力。近年来，国内外在脑卒中的基础研究和临床治疗方面取得了很大进展。在“缺血瀑布”启动前进行的超早期治疗,特别是针对自由基损伤，细胞内钙超载，兴奋性氨基酸毒性作用以及代谢性酸中毒等进行的联合治疗，可以在很大程度上减轻脑局部缺血区神经元损伤，改善患者预后。本研究以沙土鼠脑缺血再灌注模型为研究对象，以超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)为指标，观察分析灵芝防治脑缺血再灌注的机理，为探讨灵芝对脑卒中的临床治疗及拓宽灵芝药用市场提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康成年清洁级蒙古沙土鼠，雌雄各半，体重(65±5) g，由浙江医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(浙)2003-0001。

1.1.2 药物、试剂与仪器 赤灵芝制剂( 灵芝菌合剂) 由山东四维制药股份有限公司提供，本品为浅棕色混悬液体。批准文号：国药准字Z200220083。SOD测试盒、MDA测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供，按说明进行配制使用。722分光光度计(上海第三分析仪器厂)。其它试剂及仪器均来自泰山医学院机能实验室。

1.2 方法

1.2.1 沙土鼠脑缺血再灌注模型的建立 严格选择体重在(65±5)g的健康成年沙土鼠，雌雄不分，乙醚麻醉，仰卧于手术台上，颈部正中切口，游离双侧颈总动脉，待沙土鼠清醒后用无创伤微动脉夹夹闭颈总动脉，造成沙土鼠前脑缺血状态，持续7 min后去除微动脉夹形成再灌注状态，缝合创口，常规条件下饲养。脑缺血再灌注模型成功的判断标准：夹闭微动脉夹后3 min之内，翻身反射消失，钳夹前趾疼痛反射消失，除去微动脉夹后1～10 min完全清醒。不符合以上标准者视为不合格，将动物剔除。假手术组除不夹闭颈总动脉外，其余操作与以上操作相同，手术期间用白炽灯维持沙土鼠肛温在(37±0.5)℃。

1.2.2 分组及给药 成年健康清洁级蒙古沙土鼠70只，随机分为假手术组、脑缺血再灌注组、灵芝预防干预组和灵芝治疗组。取赤灵芝制剂，按照200 ml/Kg(主要含灵芝多糖2.0 g/L)的剂量灌胃给药。假手术组：作颈总动脉分离手术，不作颈总动脉短暂性夹闭手术。缺血再灌注组：作颈总动脉短暂性夹闭手术，没有任何干预措施，分别于脑缺血再灌注术后3天及10天各处死10只沙土鼠。灵芝预防组的沙土鼠于脑缺血再灌注手术前10天预防性应用赤灵芝制剂(200 ml/Kg灌胃给药)，连续10天，最后一次给药后30 min乙醚麻醉，作脑缺血再灌注手术，分别于再灌注术后3天及10天各处死10只沙土鼠取材。灵芝治疗组的沙土鼠作脑缺血再灌注手术，并于脑缺血再灌注手术完毕当时按照以上同样剂量灌胃给药，每天1次，连续用药，分别于脑缺血再灌注术后3天及10天各处死沙土鼠10只取材。

1.2.3 脑组织蛋白含量测定 用精度为万分之一的电子天平准确称取待测脑组织的重量，按重量体积比加生理盐水制备成10%的脑组织匀浆， 3000 r/min，离心10 min,取上清用生理盐水1︰9稀释,待测。血清按血清︰生理盐水=1︰49稀释,待测。操作：空白管加蒸馏水0.5 ml，标准管加蛋白含量为1 mg/ml的标准液0.5 ml，测定管加0.5 ml的样品，以上各管均加3.0 ml CBBG250显色剂，振荡混匀，静置10 min，用751分光光度计于波长595 nm处，空白管调零，测各管吸光度，计算蛋白含量。

1.2.4 脑组织及血清MDA测定 根据实验操作，分别配制标准管、标准空白管、测定管以及测定空白管。用漩涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃ 水浴40 min，取出后流水冷却，然后4000 r/min，离心10 min。取上清液，用751分光光度计于波长532 nm处，蒸馏水调零，测各管吸光度值，根据计算公式计算各样本MDA含量。

1.2.5 脑组织及血清SOD活力检测 根据实验操作，分别配制测定管、对照管。用漩涡混匀器充分混匀，置37℃恒温水浴40 min，用751分光光度计于波长540 nm处，蒸馏水调零，测各管吸光度值，按公式计算各样本SOD含量。

2 结 果

2.1 赤灵芝制剂对脑缺血再灌注沙土鼠大脑MDA及血清MDA含量的影响

赤灵芝制剂预防10天组及治疗10天组脑内MDA含量均低于脑缺血对照组，相比较有显著性差异(P﹤0.01～0.05)。预防3天组及治疗3天组脑MDA含量均低于脑缺血3天对照组，相比较有显著性差异(P﹤0.01)，但是与脑缺血10天对照组相比较无显著性差异(P﹥0.05)。治疗10天组脑MDA含量低于预防治疗10天组，二者相比较有统计学意义(P﹤0.01)。

预防治疗10天组及治疗10天组血清内MDA含量均低于脑缺血对照组，相比较有显著性差异(P﹤0.01)。赤灵芝制剂预防3天组与治疗3天组血清内MDA含量均略低于脑缺血对照组，但相比较无统计学意义。结果见表1。

表1 赤灵芝制剂对脑缺血再灌注沙土鼠大脑MDA及血清 MDA含量的影响

注：与3天对照组和10天对照组相比较，﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01。

2.2 赤灵芝制剂对脑缺血再灌注沙土鼠大脑SOD及血清SOD含量的影响

赤灵芝制剂预防10天组、治疗10天组及预防3天组脑内SOD含量均高于生理盐水对照组，相比较有显著性差异(P﹤0.01～0.05),治疗3天组SOD含量略高于对照组，但是无统计学意义。治疗10天组脑SOD含量高于预防治疗10天组，二者相比较有统计学意义(P﹤0.01)。

赤灵芝制剂预防10天组、治疗10天组及预防3天组血清SOD含量均高于生理盐水对照组，相比较有显著性差异(P﹤0.01～0.05)。治疗3天组SOD含量略高于对照组，但是无统计学意义。治疗10天组脑SOD含量略高于预防10天组，二者相比较无统计学意义。结果见表2。

表2 赤灵芝制剂对脑缺血再灌注沙鼠脑SOD及血清SOD的影响

注：与3天对照组和10天对照组相比较，﹡P<0.01。

3 讨 论

自由基是指某些原子的外层轨道中有不成对的电子基团，它具有非常活泼的化学性质，可以直接攻击细胞或损伤并产生更多的自由基团，甚至引起链式反应[1]。在正常代谢中可产生自由基，但体内存在抗氧化系统如超氧化物歧化酶等，通过一些化学反应可以缓冲及清除自由基而避免其伤害作用。氧自由基攻击生物膜磷脂中的多不饱和酸引发脂质过氧化作用；一者可引起细胞代谢和功能障碍，甚至死亡，二者可形成新的氧自由基。丙二醛为脂质过氧化的代谢产物，其含量的测定在一定程度上间接反应细胞损伤的程度。徐运等[1]通过实验证实脑缺血后，亚细胞器损害首当其冲，缺血后导致的氧化还原反应异常，在线粒体呼吸链和微粒体电子传递系统的参与下，才能产生氧自由基，这是细胞内氧自由基大量产生的最初来源。缺血再灌注期，本来有利于清除氧自由基的SOD酶促反应，此时却成了羟自由基(OH-)产生的中间环节，在梗塞灶及边缘区内，大量氧自由基迅速产生而SOD酶活性抑制的情况下，随再灌流进入局部的活性SOD在短时间内催化生成大量的H2O2,并在Fe3+参与下，产生大量OH-。此时再灌注造成局部氧分压过高，也是自由基大量生成的因素。再灌注产生大量的OH-最为危险，几乎能攻击活细胞的每一种分子。

现已证实灵芝中含有较多的活性物质，如多糖类、有机酸等，能促进新陈代谢，使SOD活性明显提高；丰富的微量元素，如铜、锌、铁、锰以及维生素等都能对提高SOD活性起到一定作用[2]。王黎等[3]通过实验证实灵芝多糖可明显改善失血性休克再灌注时血液流变学特性，改善微循环，提高红细胞SOD活性，降低血浆MDA含量，抑制血液过氧化，同时也证实灵芝多糖具有清除体内氧自由基、抗氧化、保护失血性休克再灌注时心肌损伤的作用[4]。王英[5]通过研究证实灵芝水煎剂的抗氧化作用是通过增强酶的活性，消除自由基，抑制脂质过氧化这一途径实现的。

本实验研究结果显示，预防10天组、治疗10天组脑组织、血清内MDA含量均低于脑缺血生理盐水对照组，其脑组织和血清内SOD含量均高于脑缺血生理盐水对照组，相比较有显著性差异(P﹤0.01～0.05)。预防3天组、治疗3天组脑组织及血清内MDA含量均低于3天对照组，有显著性差异(P﹤0.01)。说明赤灵芝制剂能显著提高脑缺血沙土鼠机体SOD活性，降低机体MDA含量,清除脑缺血再灌注产生的过量的氧自由基，从而改善脑缺血再灌注损伤导致的脑组织超微结构的改变，有较好的脑保护作用。这与龚菊芳等[6]报道的灵芝能显著提高血虚小鼠所测器官中的SOD活性以及张强等[7]报道的灵芝多糖能显著降低机体各组织的脂质过氧化物含量相一致。

赤灵芝制剂在脑缺血再灌注过程中的脑保护作用，在本课题的其他文章中已做描述，其机制之一可能是通过提高脑及血清SOD活力，降低脑及血清MDA含量，从而通过抑制自由基的生成发挥作用。

[1] 徐运，徐艳，李传文.脑缺血和再灌注鼠亚细胞水平MDA、SOD变化及中药的影响[J].临床神经病学杂志，1997，10(2)：72-76.

[2] 李仪奎.中药药理实验方法[M].上海：上海科学技术出版社，1991.

[3] 王黎，陈洁，裴瑞，等.灵芝多糖对兔失血性休克再灌注血液流变学和脂质过氧化的影响[J].中国中西医结合急救杂志，2004，11(4)：214-218.

[4] 杨红梅，王黎，陈洁，等.失血性休克复苏时心肌损伤和一氧化氮的变化及灵芝多糖的干预作用[J].中国中西医结合急救杂志，2003，10(5)：304-306.

[5] 王英.灵芝水煎剂对老年大鼠NO、GSH-PX、LIP以及免疫功能影响的实验研究[J].牡丹江医学院学报，2003，24(5)：5-10.

[6] 龚菊芳，劭邻相，金雷.灵芝促学习记忆及抗衰老作用实验研究[J].时珍国医国药，2003，14(10)：242-245.

[7] 张强.灵芝实验研究进展[J].时珍国医国药，1999，10(8)：622-623.