郑洋群 尹以杭 余思廷 赵晓雷 关信 郑元

文章編号：2096-398X2024）03-0057-08

（西南林业大学 林学院， 云南 昆明 650224）

摘 要：牛樟芝是我国台湾特有的珍稀药食两用真菌，含有丰富活性成分，具有抗癌、抗肿瘤和保肝等多种药理作用，三萜类化合物被认为是牛樟芝中的重要药用物质，不同提取工艺对牛樟芝总三萜得率影响不同.为探究牛樟芝总三萜最佳提取工艺及其抗氧化活性.选取不同提取溶剂、温度、时间、液料比，采用单因素试验方法和正交试验方法探究不同因素对牛樟芝总三萜得率的影响，并通过高效液相色谱（HPLC）分析不同溶剂提取工艺之间的成分差异，比较分析其抗氧化活性.结果表明，牛樟芝总三萜提取最佳工艺为：二氯甲烷为提取溶剂、液料比1∶320 g·mL-1、45 ℃提取5 h.在此条件下，牛樟芝总三萜得率为10.16±0.077 6%，通过HPLC分析，所得粗提物成分丰富且具有较好的抗氧化活性，其中DPPH清除能力的IC50值达0.137 6，总还原能力达58.03%.通过对牛樟芝提取工艺优化显著提高了牛樟芝总三萜得率，为牛樟芝活性成分提取、化合物分离及开发利用提供理论参考.

关键词：牛樟芝； 总三萜； 正交试验； 抗氧化活性

中图分类号：R284.1    文献标志码： A

Study on optimization of extraction process of total triterpenoids from Antrodia cinnamomea and its antioxidant activity

HENG Yang-qun， YIN Yi-hang， YU Si-ting， HAO Xiao-lei， GUAN Xin， HENG Yuan*

Forestry College， Southwest Forestry University， unming 650224， China）

Abstract：Antrodia cinnamomea is a rare medicinal and edible fungus unique to Taiwan，China.It contains rich active ingredients and has various pharmacological effects such as anticancer，anti-tumor，and liver protection.Triterpenoids are considered important medicinal substances in Antrodia cinnamomea，and different extraction processes have different effects on the total triterpenoids yield of Antrodia cinnamomea.In order to explore the optimal extraction process and antioxidant activity of total triterpenoids in Antrodia cinnamomea.Different extraction solvents，temperature，time，and liquid-solid ratio were selected.Single factor experiments and orthogonal experiments were used to investigate the effects of different factors on the yield of total triterpenoids in Antrodia cinnamomea.High performance liquid chromatography HPLC） was used to analyze the compositional differences between different solvent extraction processes and compare their antioxidant activity.The results showed that the optimal extraction process for total triterpenes in Antrodia cinnamomea was dichloromethane as the extraction solvent，a liquid to material ratio of 1∶320 g·mL-1，and extraction at 45 ℃ for 5 hours.Under these conditions，the yield of total triterpenoids from Antrodia cinnamomea was 10.16±0.077 6%.Through HPLC analysis，the crude extract obtained is rich in components and has good antioxidant activity.The IC50 value of DPPH scavenging ability was 0.137 6，and the total reducing ability was 58.03%.By optimizing the extraction process of Antrodia cinnamomea，the total triterpenoid yield of Antrodia cinnamomea was significantly improved，providing theoretical reference for the extraction of active ingredients，compound separation，and development and utilization of Antrodia cinnamomea.

Key words：Antrodia cinnamomea； total triterpenoids； orthogonal test； antioxidant activity

0 引言

牛樟芝（Antrodia cinnamomea）隶属于多孔菌科（Fomitopsidaceae）、薄孔菌属（Antrodia），是我国台湾特有的珍稀药食两用真菌.在自然条件下牛樟芝仅腐生于我国台湾保育树种牛樟（Cinnamomum kanehirai）腐朽的树干心材内壁或倒伏的树干潮湿表面［1，2］.牛樟芝含有丰富的三萜类、甾醇类、泛醌类及琥珀酸和马来酸衍生物等活性成分，具有良好的抗癌、抗肿瘤、抗氧化、保肝、抑菌消炎等作用，被誉为“森林中的红宝石”，其中三萜类化合物被认为是牛樟芝中的主要药用物质，野生牛樟芝子实体的三萜类化合物含量超过10%，远高于灵芝的1%～3%，对肝癌、肺癌、结肠癌和乳腺癌等治疗有良好作用［3-8］.牛樟芝因其特殊抗癌功效具有广阔的市场前景，在台湾地区已有人工种植，目前已在医疗、保健、化妆品等领域推广应用，且价格不菲.

目前，对于牛樟芝提取多采用传统室温提取或超声辅助提取以及CO2超临界萃取技术，所用提取溶剂多为甲醇或乙醇［9-11］.而有关不同提取溶剂、温度、液料比及时间对牛樟芝总三萜含量及抗氧化活性的影响的研究有待深入探讨.不同提取溶剂极性不同，对于不同成分溶解性也不同，导致提取效果存在较大差异［12，13］.本研究基于单因素试验结果，通过正交试验方法进行牛樟芝提取工艺优化，探究不同因素对牛樟芝总三萜得率的影响，通过HPLC分析不同溶剂提取之间的成分差异，并研究其抗氧化活性，为牛樟芝活性成分的提取分离及开发利用提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验试剂与仪器

1.1.1 主要试剂

香草醛，分析纯，天津奥普升化工有限公司；高氯酸、乙酸乙酯、冰醋酸，均为分析纯，成都市科隆化学品有限公司；甲醇、三氯甲烷、二氯甲烷、丙酮、95%乙醇，均为分析纯，云南杨林工业开发区汕滇药业有限公司；齐墩果酸，HPLC≥98%，上海麦克林生化科技服份有限公司；磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，均为分析纯，天津市大茂化学试剂厂；乙腈，色谱纯，上海星可高纯溶剂有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，HPLC≥98%，上海源叶生物科技有限公司；铁氰化钾、三氯化铁、三氯乙酸，均为分析纯，广东光华科技股份有限公司.

1.1.2 主要仪器

TGL-16G离心机，上海安亭科学仪器厂；UV-6100型紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；AX224H/E电子天平，奥豪斯仪器有限公司；SpectraMax 190酶标仪，美国Biorad 公司；HWS-250恒温培养箱，北京中兴伟业仪器有限公司；HCJ-4磁力搅拌水浴锅，匡贝实业有限公司；AW-CJ-2FD超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；SO510C高压灭菌锅，重庆雅马拓科技有限公司；Agilent 1260 型高效液相色谱仪、Agilen ORBAX SB-C18色谱柱，美国 安捷伦科技有限公司.

1.2 试验方法

1.2.1 牛樟芝菌丝体粉末制备

牛樟芝菌株（AC002）经ITS及形态鉴定，现保存于西南林业大学云南省森林灾害预警与控制重点实验室.选用PDA培养基进行牛樟芝培养，在超净工作台接种活化牛樟芝，于恒温培养箱28 ℃暗培养30 d.将达到培养时间的牛樟芝菌丝体烘干后粉碎过80目筛备用.

1.2.2 牛樟芝总三萜得率测定

参照冯路瑶［14］的方法，以齐果酸为标准品，用95%乙醇配制成质量浓度200 μg·mL-1标准溶液，分别精确吸取标准液0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL于10 mL具塞试管中，随后将试管置于100 ℃沸水中挥干，分别向试管中加入1 mL的5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL的高氯酸溶液，混匀于60 ℃水浴加热20 min，随后取出试管于冰水中冷却后加入5 mL冰醋酸混匀，在550 nm波长处测量吸光值.以吸光值和标准品质量建立标准曲线，通过标准曲线计算牛樟芝样品总三萜含量.牛樟芝样品总三萜测量方法同以上步骤，用公式（1）计算牛樟芝总三萜得率.

三萜得率=m×vM×V×100（1）

式（1）中：m为标准曲线中计算牛樟芝总三萜含量（μg·mL-1），v为提取时提取液体积mL；M为牛樟芝质量（g）；V为吸取供试品溶液（mL）.

1.2.3 单因素优化试验

基于预试验结果，对提取溶剂、液料比、温度及时间4个重要因素进行优化.精确称取牛樟芝菌丝体粉末0.1 g，按照液料比1∶160 g·mL-1分别加入甲醇、95%乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮溶液，25 ℃提取5 h，主要考察提取溶剂对牛樟芝菌丝体总三萜得率影响.牛樟芝菌丝体粉末与甲醇按照液料比1∶40 g·mL-1、1∶80 g·mL-1、1∶160 g·mL-1、1∶320 g·mL-1、1∶640 g·mL-1、1∶1 280 g·mL-1混合均匀，25 ℃提取5 h，主要考察提取液料比对牛樟芝菌丝体总三萜得率影响.牛樟芝菌丝体按照1∶160 g·mL-1与甲醇混合均匀后分别在10  ℃、15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃提取5 h，主要考察提取温度对牛樟芝菌丝体总三萜得率的影响.牛樟芝菌丝体粉末与甲醇按照1∶160 g·mL-1混匀，25 ℃提取0.5 h、1 h、3 h、5 h、7 h、9 h，主要考察提取時间对牛樟芝菌丝体三萜得率影响，每组试验平行重复三次.

1.2.4 正交试验方法

在单因素试验结果上，选取对牛樟芝总三萜影响较为显著的提取溶剂（A）、温度（B）、液料比（C）采用L 933）正交试验方法，设3个因素，每个因素设置3个水平，以总三萜得率为考察指标，因素与水平见表1，每组试验平行重复三次.

1.2.5 高效液相试验方法

将不同溶剂提取下牛樟芝菌丝体粗提物，用甲醇配制成100 mg·mL-1溶液，0.45 μm有机膜过滤，使用Agilen ORBAX SB-C18色谱柱9.4×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-水（B），洗脱梯度：0～60 min，30%～100%A；流速：3 mL·min-1；波长：210 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL.

1.2.6 牛樟芝菌丝体抗氧化活性测定

通过样品对DPPH自由基清除能力、总还原能力和抗氧化能力综合指数对不同提取方式下样品的抗氧化活性进行综合评价.参照范琳等［15］的方法，通过牛樟芝样品对DPPH自由基清除的IC50值评价牛樟芝抗氧化活性，数值越小表示其清除能力越强反之越弱.将不同提取方式下牛樟芝粗提物用95%乙醇稀释成1 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.125 mg·mL-1、0.062 5 mg·mL-1、0.031 3 mg·mL-1、0.015 6 mg·mL-1样品溶液，以VC（0.001 mg·mL-1、0.002 mg·mL-1、0.003 9 mg·mL-1、0.007 8 mg·mL-1、0.015 6 mg·mL-1、0.031 3 mg·mL-1）作为阳性对照，在96孔板中加入不同浓度待测样品溶液100 μL，再分别加入100 μL的95%乙醇配制的DPPH（0.1 mmol·mL-1）溶液，摇匀置室温避光反应30 min，以95%乙醇代替样品作为对照，使用酶标仪在517 nm波长处测定样品吸光度.每个处理平行测定3次.使用公式（2）计算样品对DPPH自由基清除率，根据牛樟芝样品浓度与清除率计算样品IC50值（清除率为50%时对应样品浓度）.

清除率=1-D1-D2D×100%（2）

式（2）中：D1为样品与DPPH混合溶液吸光值，D2为95%乙醇代替DPPH吸光值，D为乙醇代替样品吸光值.

采用铁氰化钾显色法进行总还原能力测定，参照杨玲等［16］的方法，将不同提取条件下的牛樟芝粗提物用95%乙醇稀释成2 mg·mL-1样品溶液，以VC（2 mg·mL-1）作为阳性对照进行测定.取不同处理样品溶液100 μL于2 mL试管中分别加入100 μL的0.2 mol·L-1的PBS缓冲液和100 μL质量分数为1%铁氰化钾溶液，在50 ℃水浴下反应20 min后冷却，加入100 μL质量分数为10%三氯乙酸放入离心机离心（4 000 r/min），取100 μL上清液于96孔板中加入100 μL质量分数为0.1%三氯化铁溶液，混合均匀后在酶标仪700 nm波长处测定吸光值.使用公式（3）计算样品的总还原能力，每个处理平行测定3次.

总还原力=A1-A0（3）

式（3）中：A1为样品吸光度，A0为蒸馏水代替样品吸光值，结果数值越大总还原能力越好.

通过抗氧化能力综合指数对样品的抗氧化活性进行综合评价，抗氧化能力综合指数为样品的DPPH清除能力指数和总还原能力指数两者的平均值.抗氧化能力综合指数计算参照考Seeram等［17］的方法.将DPPH自由基清除能力最强的样品的清除能力指数定义为100，按照公式（4）分别计算其余样品的DPPH自由基清除能力指数.定义总还原能力最强的样品的总还原能力指数为100，按照公式（5）计算其余样品的总还原能力指数.

自由基清除能力指数=IC50，b/IC50，s×100（4）

式（4）中：IC50，S为样品的IC50值，IC50，b为自由基清除能力最强的样品的IC50值.

总还原能力指数=AS/Ab×100%（5）

式（5）中：As为样品的总还原能力，Ab为样品中最高的总还原能力.

1.3 统计分析

采用WPS Office 2020和SPSS 23.0软件［18］进行统计分析，采用单因素方差分析及LSD多重比较法进行各处理间的差异显著性分析（P＜0.05），图表中小写字母代表不同处理在P＜0.05水平差异显著.各项指标数据均以平均值±标准误表示.

2 结果与讨论

2.1 牛樟芝总三萜质量分数标准曲线

以标准品质量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制牛樟芝总三萜标准曲线，结果如图1所示，所得标准品线性回归方程为y=0.004 2x + 0.102 4（R2=0.998 1）.每个处理平行测定3次.

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取溶剂对牛樟芝总三萜含量影响

目前，对于牛樟芝的提取中所用提取溶剂多为甲醇或乙醇，然而不同提取溶剂极性不同，溶解性也不同，导致提取效果存在较大差异，因此选取合适的提取溶剂进行工艺优化具有重要意义，合适提[JP3]取溶剂能使目标产物充分提取，从而提高目标产物得率，减少损失.本试验按照液料比1∶160 g·mL-1分别加入甲醇、95%乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮溶液，25 ℃提取5 h，主要考察提取溶剂對牛樟芝总三萜得率影响.结果如图2所示，通过差异显著性分析，二氯甲烷与其余溶剂处理相比牛樟芝总三萜得率均存在显著差异（P＜0.05）.不同提取溶剂对牛樟芝总三萜得率影响不同，从小到大依次为：二氯甲烷＞丙酮＞甲醇＞乙酸乙酯＞三氯甲烷＞95%乙醇，不同提取溶剂极性不同，使得牛樟芝中总三萜溶解度不同，提取溶液极性与牛樟芝所含三萜极性相似则有利于溶出［19］.当提取溶剂为二氯甲烷、丙酮和甲醇时牛樟芝总三萜溶出较高.

2.2.2 提取液料比对牛樟芝总三萜含量影响

牛樟芝菌丝体粉末与甲醇按照液料比1∶40 g·mL-1、1∶80 g·mL-1、1∶160 g·mL-1、1∶320 g·mL-1、1∶640 g·mL-1、1∶1 280 g·mL-1混合均匀，25 ℃提取5 h，主要考察提取液料比对牛樟芝菌丝体总三萜得率影响.结果如图3所示，通过差异显著性分析，液料比1∶640 g·mL-1与其余处理相比牛樟芝总三萜得率均存在显著差异（P＜0.05）.随着液料比增加牛樟芝总三萜呈现先上升后下降趋势，在液料比1∶40 g·mL-1到1∶640 g·mL-1之间，总三萜含量随液料比增加而增加，液料比增加提升牛樟芝粉末与提取溶剂浓度差，增加接触有利于牛樟芝总三萜成分向溶剂中扩[JP5]散.当液料比大于1∶640 g·mL-1时，牛樟芝得率不再增加并开始下降，其原因可能是在1∶640 g·mL-1时大部分牛樟芝总三萜已经提取出，继续增加的液料比增加溶液中非目标产物并导致稀释效应，使得牛樟芝总三萜得率下降［20］.

2.2.3 提取温度对牛樟芝总三萜含量影响

牛樟芝菌丝体按照1∶160 g·L-1与甲醇混合均匀，在温度为10 ℃、15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃提取5 h，主要考察提取温度对牛樟芝菌丝体总三萜得率影响，结果如图4所示，通过差异显著性分析，不同提取温度处理间均存在显著差异（P＜0.05）.在试验范围内牛樟芝总三萜得率随着温度升高而升高并趋于平缓，温度升高促进分子运动，加快扩散速度提高扩散能力，低温不利于三萜化合物溶出，而过高温度会破坏三萜化合物结构或导致其他成分溶出影响目标产物含量［21］.

2.2.4 提取时间对牛樟芝总三萜含量影响

牛樟芝菌丝体粉末与甲醇按照1∶160 g·L-1混匀，25 ℃提取0.5 h、1 h、3 h、5 h、7 h、9 h，主要考察提取时间对牛樟芝菌丝体总三萜得率影响.结果如图5所示，通过差异显著性分析，0.5和1 h与其余处理间均存在显著差异（P＜0.05），其余处理之间差异不显著.随着提取时间增加牛樟芝总三萜得率变化趋势为先升高后逐渐下降趋势.在5 h之前，随着提取时间增加总三萜含量逐渐增加，牛樟芝粉末与提取溶剂接触时间提升有利于牛樟芝总三萜溶出，5 h时达最大值，之后再延长提取时间，牛樟芝总三萜缓慢下降，其原因可能是随着时间延长提取溶液趋于饱和，导致一定程度析出［22］.

2.3 正交试验结果分析

三萜类化合物被认为是牛樟芝中重要的药用活性成分，因此本试验以总三萜得率为评价指标，进行牛樟芝总三萜提取工艺优化.根据单因素试验结果可知时间对牛樟芝总三萜得率影响明显小于另外三个因素，因此在正交试验中选取提取溶剂（A），液料比（B），温度（C）三个因素进行试验，考察其对牛樟芝总三萜得率影响，试验结果如表2所示，方差分析结果如表3所示.

由表2可知，对牛樟芝总三萜得率影响因素大小顺序依次为：提取溶剂（A）＞液料比（B）＞温度（C），最佳提取工艺为A2B2C2，即牛樟芝菌丝体粉末以二氯甲烷为提取溶剂，液料比1∶320 g·mL-1，45 ℃提取5 h，在此条件下，牛樟芝总三萜得率较其余处理提高5.13倍（组合7）～0.73倍（组合6）.由表3可知，三个因素对于牛樟芝总三萜得率影响均未达显著水平.黄红雨等［23］和邓春萌等［24］对牛樟芝提取工艺优化，三萜得率为3.43%～5.26%.本试验中通过工艺优化，牛樟芝总三萜得率为10.16%，显著高于前人研究，前人研究中多采用甲醇或乙醇提取，而本试验中筛选出的最佳提取溶剂为二氯甲烷.

2.4 验证试验

正交试验得出最佳提取工艺为A2B2C2，即牛樟芝菌丝体粉末以二氯甲烷为提取溶剂，液料比1∶320 g·mL-1，45 ℃提取5 h，对此提取条件进行6组平行试验，牛樟芝菌丝体总三萜得率为10.16±0.077 6%，与正交试验10.11%相符，具有较好重复性.

2.5 抗氧化能力

2.5.1 DPPH自由基清除能力

不同提取方式下粗提物对DPPH自由基清除能力以IC50值表示，值越小表示清除能力强，以VC作为阳性对照.对正交试验9个不同组合方式所得粗提物分别进行抗氧化试验，结果如表4、图6所示.由表4可知，不同处理下粗提物清除能力均低于阳性对照，通过差异显著性分析，VC阳性对照和组合7与其余提取组合方式下DPPH自由基清除能力（IC50）存在显著差异（P＜0.05）.在不同组合间，组合5的IC50最小为0.137 6，表明其对DPPH自由基清除能力最强，其DPPH自由基清除能力较其余组合处理提高4.50倍组合7）～0.21倍组合6）.由图6可知，随着样品浓度增加清除能力也随之加强，呈多项式函数关系，当测量浓度为1 mg·mL-1时，不同提取方式下清除率达76.24%（组合7）～97.53%（组合6）之间，以上结果表明牛樟芝菌丝体具有较好DPPH清除能力.

2.5.2 总还原能力

采用铁氰化钾显色法测定样品对Fe3+的还原能力是评价样品抗氧化能力的常用指标之一，以VC为阳性对照，测定不同提取方式下牛樟芝总还原能力.不同提取方式下牛樟芝总还原能力均低于VC（394%）对照.经差异显著性分析，组合5和组合6与其余组合处理间牛樟芝总三萜存在显著差异（P＜0.05），其余处理之间差异不显著.不同提取组合的总还原能力结果如图7所示，当提取溶剂为二氯甲烷时总还原能力显著高于其余处理溶剂，其中组合5总还原能力最高达58.03%，高于其余处理组合47.84倍（组合7）～0.02倍（组合6）.

2.5.3 抗氧化能力综合指数比较

通过抗氧化能力综合指数对不同提取方式下样品的抗氧化活性进行综合评价，结果如图8所示.

经差异显著性分析组合5、组合6和组合7与其余组合处理间均存在显著差异（P＜0.05），其余處理之间差异不显著.由图8可知，对比抗氧化能力综合指数可知，牛樟芝粗提物抗氧化活性大小为：组合5＞组合6＞组合4＞组合3＞组合2＞组合9＞组合1＞组合8＞组合7.牛樟芝粗提物抗氧化活性均以二氯为提取溶剂时最高，其中组合5最高，组合6次之，且组合5为正交试验中筛选最佳提取工艺组合.这可能是因为二氯甲烷提取的粗提物总三萜含量高于其余溶剂提取的粗提物，以及二氯甲烷更有利于抗氧化活性成分提取.汪雯翰等［25］研究中发现牛樟芝二氯甲烷萃取物对于过氧化氢清除能力优于石油醚与正丁醇.

2.5.4 牛樟芝总三萜含量与抗氧化活性的相关性

牛樟芝总三萜含量与抗氧化活性的相关性如表5所示.由表5可知，牛樟芝总三萜含量与DPPH自由基清除能力、总还原能力和抗氧化能力综合指数呈极显著正相关关系（r=1，P＜0.01）.表明三萜含量越高，抗氧化活性越强，已有大量研究表明三萜类化合物具有较好的抗氧化作用［26］.常超等［27］研究发现日本荚蒾果实提取物对DPPH自由基清除能力随其三萜含量增加而升高.夏必帮等［28］对桂花精油研究表明三萜类化合物具有较强的抗氧化能力.赵玲艳等［29］对枸骨抗氧化活性研究发现，枸骨的抗氧化能力来源于由于其体内富含的枸骨三萜皂苷.三萜成分能够提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性，这些酶参与消除有害的活性氧，从而抑制氧化反应，起到抗氧化作用［30，31］.本试验中提取工艺优化显著提高了牛樟芝总三萜含量，继而增强其抗氧化活性.

2.5.5 高效液相结果分析

根据正交试验结果，分别选择甲醇（MeOH）、二氯甲烷（DCM）、丙酮（PA）三种提取溶剂的最优提取条件进行牛樟芝提取，并通过高效液相分析不同提取处理间的物质成分差异.三种提取溶剂的最优条件分别为：甲醇，液料比1∶640 g·mL-1，45 ℃，提取5 h；二氯甲烷，1∶320 g·mL-1，45 ℃提取5 h；丙酮，1∶640 g·mL-1，55 ℃提取5 h，其结果如图9所示.

由图9可知，不同处理下牛樟芝粗提物的成分丰富程度依次为：二氯甲烷提取＞丙酮提取＞甲醇提取，且以二氯甲烷为提取溶剂，所得粗提物的成分含量及丰富程度明显优于其余两种提取溶剂.在2.9 min检测出現第一个高峰面积大小为：DCM提取＞MeOH提取＞PA提取，其中DCM粗提物检测出的峰面积较MeOH和PA粗提物分别提高了12.7倍和1.10倍.随后检测出的物质峰面积为：DCM提取＞PA提取＞MeOH提取，其中7.5 min检测出的第二个高峰中DCM粗提物检测出的峰面积较PA和MeOH粗提物分别提高了1.26倍和12.90倍.30 min前，MeOH粗提物的峰值主要出现在此时间段，主要为中小极性物质；30 min后所出现峰多为DCM和PA粗提物特有，表明DCM和PA能提取更多中大极性化合物.从HPLC分析结果得知，二氯甲烷为最佳提取溶剂.

3 结论

本试验以总三萜得率为评价指标，进行牛樟芝总三萜提取工艺优化，选取不同提取溶剂、温度、时间、液料比四个因素，在单因素试验基础上进行正交试验.本研究发现，牛樟芝总三萜的最优提取工艺为：二氯甲烷提、液料比1∶320 g·mL-1、45 ℃提取5 h，在此条件下，显著提高了牛樟芝总三萜得率，总三萜得率达10.16±0.077 6%，通过HPLC分析，所得粗提物的成分含量和丰富度显著高于其余处理，且具有良好抗氧化活性，DPPH清除能力IC50值达0.137 6，总还原能力达58.03%.本研究结果为牛樟芝提取、化合物分离及开发利用提供参考.

参考文献

［1］ 梁 蕾，向 婷，李红保，等.牛樟芝及其药理功能.中药材，2019，42（1）：239-242.

［2］ 黄紫晴，刘青川，黄正明，等.牛樟芝的药用研究进展.中国医药科学，2023，13（16）：33-36.

［3］ Chen Y F，Wu H C，Chang J M，et al.Chemical investigations and cytotoxic effects of metabolites from Antrodia camphorata against human hepatocellular carcinoma cells.Natural Product Research，2022，37（4）：11.

［4］ Joshi R A.Antrodia camphorata with potential anticancerous activities：A review.Journal of Medicinal Plants Studies，2017，5（1）：284-291.

［5］ 李 晶，冯 娜，王升陽，等.牛樟芝化学成分及其药理作用研究进展.生物技术通报，2021，37（11）：14-31.

［6］ Guo W J，Yu J，hu D W.Chemical constituents of the artificial fruit body of Antrodia cinnamomea.Chemistry of Natural Compounds，2020，56（4）：777-779.

［7］ 李 菁，胡 佳，魏云辉，等.珍稀药用真菌牛樟芝的研究与利用进展.食药用菌，2022，30（2）：103-108.

［8］ Xin T，hang F B，Jian Q Y，et al.Isolation，purification，and antitumor activity of a novel active protein from Antrodia cinnamomea liquid fermentation mycelia.Fermentation，2023，9（2）：185.

［9］ Nam J ，Min J ，Soo  L.Antioxidant activity of methanol extracts from Lactuca indica.orean Journal of Food Preservation，2012，19（2）：294-300.

［10］ 冯锋将，刘丽云，黄凤琴，等.牛樟芝子实体中三萜类化合物的提取工艺优化.发酵科技通讯，2023，52（3）：125-130.

［11］ Jian  C，Yong F M，Qi C，et al.Efficient extraction and antioxidant activity of polyphenols from Antrodia cinnamomea.BMC Biotechnology，2022，22（1）：9.

［12］ 穆兴燕，吴 胜，郭银萍，等.不同溶剂提取对刺梨物质含量变化及抗氧化活性的影响.食品研究与开发，2023，44（17）：68-75.

［13］ Muhammad S，Iqbal A D，Aanuzilwatii A，et al.Investigation of antioxidant and antibacterial effects of citrus fruits peels extracts using different extracting agents：Phytochemical analysis with in silico studies.Heliyon，2023，9（4）：15 433.

［14］ 冯路瑶.牛樟芝人工培养工艺及三萜类成分产生规律的研究［D］.山东：鲁东大学，2017.

［15］ 范 琳，沈颖昕，严铭铭，等.葛根不同提取物体外抗氧化性及α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究.粮食与油脂，2021，34（6）：150-154.

［16］ 杨 玲，王万坤，罗丽平，等.红托竹荪菌托多糖提取工艺及抗氧化降血糖活性.菌物学报，2023，42（1）：418-429.

［17］ Seeram N P，Aviram M，hang Y J，et al.Comparison of antioxidant potency of commonly consumed polyphenol-rich beverages in the United States .Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56（4）：1 415-1 422.

［18］ 任泽熙.SPSS统计分析软件在统计学中的应用探析.电脑知识与技术，2023，19（13）：67-72.

［19］ Simon B I A，Lidianys M L L，Claudia L L E，et al.Solvent effects on phytochemical constituent profiles and antioxidant activities，using four different extraction formulations for analysis of Bucida buceras L.and Phoradendron californicum.BMC Research Notes，2015，8（1）：396.

［20］ 马婧嘉，李雅茹，张文隽，等.超声波协同半仿生法提取灵芝三萜工艺优化.食用菌，2022，44（6）：66-68.

［21］ 李金金，孟 琦，崔馨燕，等.响应面法优化地参三萜酸提取工艺及抗氧化活性分析.南方农业学报，2022，53（8）：2 261-2 271.

［22］ awtar J，Fouzia A，Farid M，et al.Optimizing the extraction of phenolic antioxidants from date palm fruit by simplex-centroid solvent mixture design.Heliyon，2023，91）：12 738.

［23］ 黃红雨，赵 虎，金晓艳.响应面试验优化牛樟芝总三萜提取工艺.食品研究与开发，2017，38（12）：30-34.

［24］ 邓春萌，王哑倩，吴美媛.牛樟芝固态发酵菌丝体三萜及多糖提取工艺优化研究.生物技术进展，2020，10（3）：328-331.

［25］ 汪雯翰，孙太萍，杨海芮，等.樟芝子实体和菌丝体萃取物的抑菌及抗氧化活性.食用菌学报，2016，23（2）：79-83.

［26］ 杨洪飞，闵 清.三萜类化合物的药理作用研究进展.湖北科技学院学报（医学版），2023，37（1）：67-71.

［27］ 常 超，蔡海莺，陈瑞达，等.超声辅助提取日本荚蒾果实总三萜工艺优化及其抗氧化活性.食品研究与开发，2023，44（15）：90-97.

［28］ 夏必帮，鲁韦韦，李 蕤.桂花精油提取工艺及其抗氧化性的研究.氨基酸和生物资源，2016，38（1）：49-52，75.

［29］ 赵玲艳，张红芳，陈崇莲，等.响应曲面法优化枸骨总皂苷的提取工艺及抗氧化活性.江苏农业科学，2017，45（22）：205-209.

［30］ 王国辉，王丽华，秦丽红，等.灵芝三萜化合物对戊四氮致痫大鼠海马神经元损伤的影响.深圳中西医结合杂志，2018，28（10）：26-27.

［31］ 张 玥，陈 林，谢 春，等.灵芝三萜类化合物对砷中毒大鼠脑组织氧化应激损伤的影响.贵州医科大学学报，2020，45（3）：277-280.

【责任编辑：蒋亚儒】

基金项目：国家自然科学基金项目（32160736）； 云南省农业基础研究联合专项重点项目（202101BD070001-020）； 云南省基础研究计划面上项目（202101AT070044）； “兴滇英才支持计划”青年人才专项项目（XDYC-QNRC-2022-0245）.

作者简介：郑洋群（1998—），女，贵州铜仁人，在读硕士研究生，研究方向：植物生理生态和药食用菌学

通讯作者：郑 元（1982—），男，云南昆明人，教授，硕士生导师，研究方向：植物生理生态和药食用菌学，m19969240964@163.com