李萌 曾婷婷 杨金初 徐永明 李欢 马林 饶智

文章編号：2096-398X2024）03-0038-08

（1.郑州轻工业大学 烟草科学与工程学院， 河南 郑州 450001； 2.河南中烟工业有限责任公司 技术中心， 河南 郑州 450000； 3.广西中烟工业有限责任公司 柳州卷烟厂， 广西 柳州 545001； 4.红云红河烟草（集团）有限责任公司， 云南 昆明 650202）

摘 要：为探究应用冠突散囊菌固态发酵提升低次烟叶品质的可行性，从茯砖茶中分离筛选冠突散囊菌并接种于低次烟叶进行固态发酵，通过感官评吸考察固态发酵对烟叶品质的影响，应用同时蒸馏萃取和GC/MS检测固态发酵过程中1、3、5、7 d的烟叶主要致香成分的变化.结果表明，从茯砖茶中成功分离到候选菌株GT-1，经形态和分子生物学鉴定确认为冠突散囊菌.将GT-1接种于低次烟叶进行固态发酵，发酵5天烟叶感官质量最佳，香气量、香气质、浓度和余味较对照均有较为明显改善.发酵烟叶中共检测出33种主要致香成分，包含16种类胡萝卜素降解产物、9种芳香族氨基酸转化产物、1种叶绿素降解产物、1种类西柏烷降解产物、6种美拉德反应产物.随着固态发酵时间的延长，烟叶主要致香成分总量呈现先上升后下降的趋势，致香成分总量在第5 d达到最高，为402.03 μg/g；相较于未发酵烟叶，致香成分含量提高了22.54%，其中4，7，9-巨豆三烯-3-酮、香叶基丙酮、二氢猕猴桃内酯、苯甲醇、苯乙醇、2-乙酰基吡咯等致香物质含量显著提高，极大的丰富了烟气的甘甜香、烟草香、果香、花香等香气.冠突散囊菌固态发酵可提高烟叶香气物质含量和种类，有效提升低次烟叶品质.

关键词：冠突散囊菌； 固态发酵； 低次烟叶； 致香成分； 发酵时间

中图分类号：TS45; S572    文献标志码： A

Effect of the solid-state fermentation with Eurotium cristatum GT-1 on the quality of low-grade tobacco leaves

LI Meng1， ENG Ting-ting1， YANG Jin-chu2， XU Yong-ming2， LI Huan3， MA Lin1， RAO hi4*

1.College of Tobacco Science and Engineering， hengzhou University of Light Industry， hengzhou 450001， China; 2.Technology Center， China Tobacco Henan Industrial Co.， Ltd.， hengzhou 450000， China; 3.Liuzhou Cigarette Factory， China Tobacco Guangxi Industrial Co.， Ltd.， Liuzhou 545001， China; 4.Hongyun Honghe Tobacco（Group）Co.， Ltd.， unming 650202， China）

Abstract：To investigate the feasibility of solid-state fermentation of low-grade tobacco leaves with Eurotium cristatum，E.cristatum was isolated from Fuzhuan tea and inoculated into low-grade tobacco leaves for solid-state fermentation.Simultaneous distillation extraction and GC/MS were used to detect the changes in the main aroma components of tobacco leaves at 1，3，5，7 days during solid-state fermentation.Sensory evaluation was conducted to investigate the impact of solid-state fermentation time on tobacco quality.The candidate strain GT-1 was successfully isolated from Fuzhuan tea，and confirmed as E.cristatum by morphological and molecular identification.The results showed that the sensory quality of tobacco leaves was the best after fermentation for 5 days，and the aroma amount，concentration and aftertaste were significantly improved compared with untreated tobacco leaves.A total of 33 main aroma components were detected，including 16 carotenoid degradation products，9 aromatic amino acid conversion products，1 chlorophyll degradation product，1 of cembranoid degradation products，and 6 Maillard reaction products.With the extension of solid-state fermentation time，the total amount of main aroma components in tobacco leaves shows a trend of increasing and then decreasing.The total amount of aroma components reaches its highest point at 402.03 μg/g on the 5th day.Compared to the C，the content of aroma components increased by 22.54%.Among them，the content of aroma substances such as 4，7，9-macrostigmen-3-one，geranylacetone，dihydrokiwifruit lactone，benzyl alcohol，phenylethanol，and 2-acetylpyrrole were significantly increased，which greatly enriching the sweet，tobacco，fruit，flower aromas of the smoke.Solid-state fermentation with E.cristatum GT-1 can increase the content and variety of aromatic substances in tobacco leaves，and thus effectively improve the quality of low-grade tobacco leaves.

Key words：Eurotium cristatum； solid-state fermentation； low-grade tobacco leaves； aromatherogenic ingredients； fermentation time

0 引言

低次烟叶是卷烟生产过程中质量较差的烟叶，具有香气量不足、杂气重、刺激性强等缺点，难以在配方中应用或仅能用于低档卷烟，如何提高低次烟叶的利用率是烟草行业中的研究热点之一.烟叶固态发酵是提高烟叶品质的一个重要环节，相比于液态发酵，固态发酵是一种接近自然状态下的发酵，发酵工艺简单、稳定，产物浓度高，发酵过程无废水、废气产生［1］.微生物在烟草发酵过程中发挥重要作用，能够降解低次烟叶中的糖类、蛋白质、纤维素等物质改善烟叶品质［2］.薛云等［3］利用芽孢杆菌固态发酵处理广西河池C4F烟叶，发酵后烟叶香气质有所改善，杂气减小，提升了烟叶利用率.李萌等［4］通过混菌固态发酵低次烟叶发现，烟叶的挥发性致香成分含量增加，香气质和香气量得到提升，烟叶品质明显改善.

冠突散囊菌Eurotium cristatum）俗称“金花菌”，是茯砖茶发酵过程中的优势微生物［5］，能够利用茶叶中的茶多酚、糖类等物质，同时分泌纤维素酶、蛋白酶、果胶酶等胞外酶促进茶叶物质的代谢，从而形成茯砖茶特有的香味［6-8］.此外，研究人员发现冠突散囊菌能够通过调节微生物菌群依赖的色氨酸代谢来缓解结肠炎的结肠损伤，具有降血糖、抑菌的作用［9，10］.冠突散囊菌目前主要应用于茯砖茶及其它茶叶的固态发酵上［8，11］，在烟草中主要应用在液态发酵中［12，13］，在固态发酵中应用较少.因此，本研究从茯砖茶中筛选冠突散囊菌应用于低次烟叶固态发酵，并探究发酵时间对于烟叶品质的影响，评价冠突散囊菌固态发酵对烟叶增香和感官质量提升的效果，旨在发掘适用于卷烟增香的微生物，改善低次烟叶的吸食品质，为提升低次烟叶的工业可用性提供新的技术手段.

1 材料与方法

1.1 实验原材料

低次烟叶由云南中烟工业有限责任公司提供；茯砖茶购自安化县安荣茶业有限公司.

琼脂粉（北京索莱宝科技有限公司）；氯化钠（东京化成工业株式会社）；蛋白胨（成都普思生物科技有限公司）；牛肉膏（河南天孚化工有限公司）；酵母粉（中国医药集团上海化学试剂公司）；2×Taq Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；真菌基因组DNA提取试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成.

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g.将去皮马铃薯切成块，加入1 000 mL去离子水，煮沸10～20 min，用纱布过滤后，加入蒸馏水至1 000 mL.将pH值调整为7.0，經121 ℃，20 min 高压灭菌后，倒入已灭菌的培养皿中，等待冷却.

酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（YPD）：葡萄糖2 g，蛋白胨2 g，酵母粉1 g，100 mL去离子水，调节pH值至7.0，121 ℃高压灭菌20 min.

1.2 实验仪器与设备

固态烟叶发酵反应舱（郑州轻工业大学研制）；恒温培养箱（济南爱来宝仪器设备有限公司）；LX-C35L型立式自动电热压力蒸汽菌器（合肥华泰医疗设备有限公司）；小型匀浆机（上海净信实业发展有限公司）；离心机（ThermoFisher赛默飞世尔科技公司）；PCR仪（AppliedBiosystems美国应用生物系统公司）；电泳仪（BIO-RAD伯乐生命医学产品有限公司）.

1.3 实验方法

1.3.1 菌株的分离纯化及鉴定

称取10 g茯砖茶叶于250 mL锥形瓶中，加入90 mL无菌水，于30 ℃、180 r/min条件下振荡2 h后，将菌悬液稀释成10-2～10-7的浓度梯度，均匀涂布在PDA平板中，置于30 ℃培养箱中培养48 h，待黄色“金花”状的菌落长出后进行分离鉴定并保藏.

形态学鉴定：将分离纯化得到的菌株进行活化，接种至PDA培养基，30 ℃培养至形成菌落，显微镜下观察菌丝和孢子形态.

分子生物学鉴定：应用试剂盒提取PDA培养基培养得到的单菌落菌株基因组DNA，以此为模板进行PCR扩增.引物为真菌鉴定通用引物ITS1 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）. PCR扩增体系（20 μL）为：2×Taq Master Mix 10 μL；上下游引物各0.5 μL；模板DNA 2 μL；ddH2O补足至20μL.PCR扩增条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s，35 个循环；72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存.扩增产物送往生工生物工程（上海）有限责任公司测序，测序结果在NCBI（National Center of Biotechnology Information，美国国家生物信息技术中心）数据库进行BLAST同源性比对，利用MEGA 7软件构建系统发育树鉴定菌株［14］.

1.3.2 固态发酵

将冠突散囊菌GT-1于PDA平板培养基上活化2次.超净工作台中用接种铲刮取孢子于100 mL已灭菌带有玻璃珠的无菌水内，振摇20 min，用脱脂棉过滤到新的无菌烧瓶内，制成均匀的孢子悬浮液，通过血球计数法［15］得到孢子悬浮液浓度为1×106 CFU/mL（该孢子悬浮液用于接种）.以上微生物实验均无菌操作.动态固态发酵条件为GT-1接种量10%，湿度 70%，温度28 ℃，转速15 rpm/min.

试验共分为原样、对照组和处理组三组进行.原样烟叶不接种GT-1，平衡48 h后直接制样进行致香成分检测和评吸.对照组烟叶不接种GT-1，平衡48 h后直接放入固态发酵反应舱中发酵7天，分别在1，3，5，7 d取出进行感官评吸.处理组烟叶平衡48 h后喷洒菌悬液，放入固态发酵反应舱中发酵7天，分别在第1、3、5、7 d取出进行感官评吸并测定烟叶挥发性致香成分含量.试验均重复3次.

1.3.3 烟叶致香成分的测定

采用同时蒸馏萃取技术结合气相色谱/质谱（GC/MS）联用测定发酵烟叶挥发性致香成分［4］.将发酵后的烟叶在 40 ℃ 烘箱中干燥，粉碎机粉碎后过孔径为 0.425 mm 筛.准确称取 25 g 烟末样品、30 g 氯化钠和 200 mL水放入同时蒸馏萃取装置一端的圆底烧瓶中，装置的另一端盛有 60 mL 二氯甲烷，在 60 ℃下水浴加热，同时蒸馏萃取 2.5 h.同时蒸馏萃取完成后，二氯甲烷萃取液用无水硫酸钠干燥，4 ℃下静置过夜，过滤，加入1 mL的内标物（乙酸苯乙酯，二氯甲烷作为溶剂）后浓缩，萃取液浓缩不足 1 mL 时，用二氯甲烷定容至 1 mL，过0.22 μm 滤膜于 2.0 mL 的色谱瓶中，立即进行上机检测.

GC/MS 检测条件：色谱柱为HP-5MS60 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度280 ℃；载气为高纯氦气；柱温箱为程序升温，起始温度50 ℃保持1 min，以4 ℃/min升至148 ℃保持1 min，以2 ℃/min升至172 ℃保持1 min，以4 ℃/min升至280 ℃保持5 min；分流比5∶1；流速3.0 mL/min.离子源温度230 ℃；四极杆温度 150 ℃；EI 离子源 70 e V；质量扫描范围35～550 amu；采用NIST 17检索.

1.3.4 感官评吸

分别将未发酵烟叶、对照和接菌发酵烟叶切丝后进行卷制，置于温度（22±1） ℃、相对湿度（60±2）%的恒温恒湿箱中平衡48 h.由7 人组成的专业评吸小组根据国家标准 YC/T 138-1998［16］中的方法进行评吸，对抽吸结果进行感官质量评价.

1.4 数据分析

应用 Excel 2010处理原始数据.应用SPSS 22.0 对试验数据进行差异显著性分析和多重比较.

2 结果与讨论

2.1 菌株的分离纯化及鉴定

2.1.1 菌落形态特征分析

候选菌株GT-1接种在PDA培养基上生长良好，菌落表面致密，孢子呈黄色（图1），与茶叶表面的“金花”形态类似.在100倍油镜下观察其菌株形态，该菌株孢子呈圆形，大部分聚集于菌丝顶端，与菌丝紧密相连，菌丝无隔膜（图2）.

2.1.2 菌株分子生物学鉴定

从茯砖茶分离纯化出的疑似冠突散囊菌的ITS 序列扩增产物的电泳结果如图3所示（图中M为Marker），在550 bp处有单一、明亮且清晰条带.获得的ITS序列在NCBI数据库进行BLAST同源性比对显示，该菌株与冠突散囊菌（E.cristatum）的序列相似度度為100%.应用GT-1菌株和近缘菌株ITS序列构建的系统发育树如图4所示.GT-1菌株与冠突散囊菌聚为一支，结合菌落和孢子形态确定菌株GT-1为冠突散囊菌.

2.2 冠突散囊菌GT-1发酵烟叶感官评吸

由7位评吸人员组成的评吸小组分别对原样、无菌水处理对照样和GT-1发酵烟叶卷制而成的卷烟进行评吸，并按照1.3.4中所述的评分方法进行评分，取评分的平均值绘制成图5.由图5可知，喷洒无菌水发酵1、3、5和7d的对照烟叶感官质量与未发酵原样类似，仅劲头略有下降，香气质和香气量均无改善.低次烟叶感官质量较差，主要表现香气量不足、香气质不佳且杂气重、余味不佳.添加GT-1显著提高了供试烟叶的感官质量，发酵5 d的评吸结果最好，其次是发酵3 d.经过接菌处理发酵后，烟叶的香气量、浓度和余味均有较为明显的改善，杂气减轻，对劲头影响不大或略有降低.微生物种群是影响发酵质量的关键因素，本研究中直接发酵未能改善供试烟叶感官质量，推测可能是烟叶携带微生物缺乏对烟叶感官质量有正向作用的功能微生物所致.

2.3 冠突散囊菌GT-1发酵烟叶主要致香成分变化

烟叶的致香物质是评价烟叶品质的重要指标［17］，接种冠突散囊菌GT-1发酵烟叶的香气质和香气量均较原样显著提升.通过同时蒸馏萃取和GC/MS对不同发酵时间冠突散囊菌GT-1发酵烟叶的致香成分进行检测，并和原样的检测结果进行比较，其致香成分变化如图6和表1所示.烟叶样品中共检测出33种主要致香成分，根据香味前体物质分类可分为五类，即类胡萝卜素降解产物、芳香族氨基酸转化产物、叶绿素降解产物、类西柏烷降解产物和美拉德反应产物［18］，分别有16种、9种、1种、1种和6种.不同发酵时间烟叶致香成分具有明显变化，致香成分含量呈现先上升后下降的趋势.随着固态发酵时间的延长，烟叶主要致香成分总量呈现先上升后下降的趋势，推测是烟叶上接种的冠突散囊菌5 d后开始衰亡、细胞代谢活力下降.与感官评吸结果一致，发酵5 d时致香成分含量达到最高，为402.03 μg/g，相较于未发酵烟叶，致香成分含量提高了22.54%，这可能是发酵烟叶感官质量提升的重要原因.

新植二烯对烟叶的品质有着重要的影响［19，20］，其含量在各个发酵阶段占比均较高，发酵5天烟叶较对照含量提高12.67%.类胡萝卜素降解产物是发酵中除新植二烯外含量最高的香气物质，类胡萝卜素降解产物含量在第5 d最高（63.56 μg/g），较原样含量提高了37.11%，该类物质能够减少烟叶刺激性，可增加花香和果香等香韵［21，22］.类胡萝卜素降解产物中4，7，9-巨豆三烯-3-酮含量占比较高，具有甘甜香和烟草香［23，24］；香叶基丙酮含量变化最大，相较于原样提高了192.37%，可丰富烟叶果香［25］，具有良好的自由基清除能力［26］.与在苦丁茶上研究结果类似［27］，发酵烟叶芳樟醇含量也有较大提升.除此之外，与原样相比，发酵烟叶检出了4种新的类胡萝卜素降解产物（β-环柠檬醛、6-甲基-5-庚烯-2-醇、愈创木酚、4-环戊烯-1，3-二酮、3-羟基-2-丁酮），这些成分具有果香、甜香和香草香.

芳香族氨基酸转化产物含量虽然占比较小，但也是烟叶重要的风味组成，具有丰富的花香香味的苯甲醇和苯乙醇［28］在发酵过程中显著变化，发酵5d分别提高了133.23%和85.81%.芳香族氨基酸转化产物中产生了3种新物质（3，4-二甲基苯甲醛、邻苯二甲酸二丁酯、3-甲基苯酚），具有杏仁香和果香［29］.茄酮是烟叶致香物质中类西柏烷降解产物的代表指标［30］，具有新鲜胡萝卜的香味，增加烟草香气，使烟气醇和细腻［31］，发酵5 d提高了72.86%.美拉德反应产物2-乙酰基吡咯具有花香、清香［32］，发酵5d提高了183.64%.

冠突散囊菌发酵可显著提高茶叶的香气物质含量与种类［27，33-35］，本研究在烟叶上也得了类似的研究结果.目前对于冠突散囊菌发酵产香的机制尚不清楚，推测可能与菌体生长及代谢过程中对大分子香气前体物的降解［36］、芳香物质的合成［37，38］及分泌胞外酶的催化作用［39，40］有关，未来可综合应用化学分析和代谢组学、基因组学及转录组学等高通量组学技术开展进一步研究.

3 结论

本研究从茯砖茶茶叶中分离、筛选得到一株冠突散囊菌GT-1并将其应用于烟叶固态发酵.发酵后烟叶感官质量提升显著，发酵5 d效果最佳，发酵后烟叶香气质和香气量显著提升，杂气减少，余味舒适.发酵烟叶香味物质种类和含量较对照烟叶均显著提高，香味物质含量总体呈现先升高再降低的趋势，其中发酵5 d烟叶香味物质含量最高，表明香气物质的增加可能是冠突散囊菌GT-1发酵烟叶感官质量提升的重要原因.本研究首次将冠突散囊菌应用于低次烟叶增香提质，后续可进一步对接种量、温度、湿度及转速等发酵条件发酵参数进行优化并对其增香机制进行深入研究，为其在卷烟工业中的应用提供基础数据.

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【责任编辑：蒋亚儒】

基金项目：国家自然科学基金项目（31401810）； 云南中烟工业有限责任公司科研项目（JB2022YL02）

作者简介：李 萌（1982—），男，河南长葛人，讲师，博士，研究方向：烟草生物技术

通讯作者：饶 智（1973—），男，云南昭通人，高级农艺师，硕士，研究方向：烟草原料与卷烟工艺，rzhyhe@163.com