都佳寅 王 宁 闫 卉

1 天津市南开医院口腔科 300110; 2 天津中医药大学附属第二医院口腔科

长期以来,微生物研究的主要手段依赖纯培养技术。据文献报道,环境中只有约5%的微生物能够被分离和纯化,而口腔中可培养的细菌也只占50%。因此,用传统的微生物培养和鉴定方法不足以反映生态环境中的真实情况,严重限制了认识口腔微生物的视野。近年来,现代分子生物学技术的成熟为微生物生态学研究提供了新的方法,促进了口腔微生物学研究的进一步发展[1]。常见的技术有限制性片段长度多态性标记技术(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)、变性梯度凝胶电泳(Denatured gradient gelelectrophoresis,DGGE)及随机扩增多态性DNA标记(Random amplified polymorphic DNA,RAPD)等。如何提取高质量的DNA,同时最大限度地减少DNA的损失,是成功应用这些技术的关键问题。由于不同细菌样本所含细菌的种类及数量不同,同一样本采用不同的DNA提取方法所得结果可能不同。因此,许多学者针对不同的样本特性,制定了各种具有针对性的DNA提取方法,以满足不同实验目的的需要,并减少假阳性或假阴性结果的产生。目前,对于口腔致病菌DNA的提取,不同的实验选择不同的方法,因此所得结果的可比性较差。本文综述目前常见的应用于口腔的分子标记技术,为口腔微生物不同的研究目的和需求选择合适的技术提供参考。

1 限制性片段长度多态性标记技术

限制性片段长度多态性标记技术(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)是指样品DNA被限制性内切酶酶切产生的DNA片段长度的变异性。传统RFLP技术的基本原理是用限制性内切酶消化样品基因组DNA,产生大量限制性片段,不同样品限制性片段的长度及数目不同,电泳后得到特异性图谱,再结合Southern杂交,检出RFLP。目前,该技术有两种改进方法,PCR-RFLP和末端限制性片段长度多态性技术(T-RFLP),以克服对基因组酶切后形成过于复杂的条带难于分析的问题。PCR-RFLP酶切经PCR扩增的特异性DNA片段。T-RFLP是在PCR-RFLP基础上对引物的5'端用荧光物质标记,得到带有荧光标记的末端限制性DNA片段(Terminal restriction DNA fragments,T-RFs),用DNA自动测序仪进行检测获得峰值图,了解群落的组成、某菌种的相对数量及样品之间的相似性等[2]。

PCR-RFLP和T-RFLP技术的核心问题在于引物—酶组合的选择,不同的组合影响图谱的特异性,在近源菌种鉴别时更为重要[3]。T-RFLP技术所得图谱无法进行杂交或直接克隆分析。在分析近缘微生物时,当扩增片段靠近荧光标记端的切点一样时,无法鉴定至种甚至是属的水平。可分别应用几种内切酶对同一分析样品分别进行消化,综合分析多个图谱,提高检出率。

2 单链构象多态性技术

单链构象多态性技术(Single-stranded Conformational Polymorphisms,SSCP)是基于DNA构象差别来检测多态性的方法。基本原理是不同的单链DNA具有序列特异性,形成的空间构象不同,在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速率不同,得到不同的电泳图谱。

SSCP的主要优点是操作简便、成本低、适合大样本筛查;引物无须GC夹,也不需要灌制梯度凝胶;在100～300bp的单链DNA点突变检出率可达97%,而300～450bp时的检出率仅为67%[4];同时该技术不能预测单链DNA迁移速度,难以估计其凝胶中的条带位置;不能识别突变位置,且当碱基互换不影响单链DNA的空间构象时,其检出率只有57%[5]。有学者利用裂解酶片段长度多态性技术(Cleavase fragment length polymorphism,CFLP),RFLP-及SSCP-PCR三种方法检测结核分枝杆菌的基因突变,SSCP和CFLP可检测短目标序列中的所有突变,CFLP在检测长目标序列中的突变时也非常具有优势[6]。

3 变性梯度凝胶电泳

基本原理为变性梯度凝胶电泳(Denatured gradient gelelectrophoresis,DGGE)时,不同序列的DNA片段在各自相应的变性剂浓度下变性,使其在聚丙烯酰胺中的电泳速度急剧下降,停留在相应的变性剂梯度位置,染色后在凝胶上获得条带图谱。电泳条带的数目、位置和强度即可反映样品中微生物的种类及相对构成比。

目前,该技术在口腔微生物研究中该技术被广泛应用,具有加样量小、分辨率高、重复性好、成本低、操作简便快速等优点。DGGE通常根据细菌16SrDNA序列中保守区设计通用引物,对可变区做PCR扩增。但16SrDNA更适对属以上进行分类,对于属内种间分类分辨率较低。Täpp等[7]利用链球菌属的rnpB基因序列对链球菌49个菌属的79个菌株进行了分类鉴定,认为其序列的差异可用于菌种区分。为提高DGGE对序列差异的分辨率,通常在引物的3’端加上30～50个碱基“G-C夹板”,从而显著提高长度超过500bp的DNA序列差异的检出率。此外,通过图谱分析软件对条带位置和强度进行分析,所得结果不能直接反映样品的数量,只反映彼此的相对数量趋势且往往存在误差,需要结合杂交技术或测序分析等得到更详尽的信息。Hakim等[8]研究发现DGGE只能对微生物群落中数量超过1%的优势种群进行分析;PCR扩增所需G-C碱基对含量至少达40%。

4 核糖体基因间隔序列分析

除16SrDNA,原核生物DNA中还有5SrDNA和23SrDNA。编码这些rRNA的基因按顺序排列在一条核DNA上,其编码顺序为16S、23S和5SrRNA。核糖体基因间隔序列分析(Ribosomal intergenic spacer analysis,RISA)技术研究位于16SrRNA和23SrRNA基因间的间隔区序列(Intergenic Spacer Region,ISR),其中还含有编码tRNA的tDNA序列,对其进行扩增称为tDNA-PCR技术。不同种属细菌间的基因间隔序列存在差异,同一菌种不同菌株的ISR不同,因此RISA技术被广泛用于菌种的亚分类以及近源种研究中,表现出更显著的序列尤其是长度多态性[9]。

该方法敏感性高,重复性好,与DGGE相比,RISA的引物无须GC夹。有时染色并不敏感,分辨率较低。有学者采用RISA结合异源双链核酸分子分析技术研究牙龈卟啉单胞菌基因多态性,认为基于rNDA操纵子的ISR可更好地鉴定不同菌株,并同时从混杂菌群中鉴定特定菌种内的一系列菌株[10]。

5 RAPD-PCR、任意引物PCR标记技术(Arbitrary primer PCR,AP-PCR)和基因组重复序列PCR(Repetitive-element PCR,rep-PCR)

许多文献将AP与RAPD归为同一种技术。基本原理源于基因组DNA分子内部存在间隔的颠倒重复序列(Inverted repeat),因此在两条模板单链上各有一个随机引物的结合部位,经PCR后产生若干单引物扩增产物,由于不同DNA的颠倒重复序列数目及间隔长度的差异,经凝胶电泳产生特异图谱。两者的主要区别在于:所需随机引物长度不同,AP通常需要第三个引物,如M13通用引物,第一个PCR循环所需引物浓度较高;AP技术PCR过程分为两个阶段。首先在不严格的条件下使引物与模板错配复性,形成可扩增序列,然后在严格条件下扩增,电泳后产生指纹图谱;基于DNA重复序列的标记技术包括肠杆菌基因间保守重复序列标记(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR,ERIC-PCR)、基因外重复回文序列PCR标记(Repetitive extragenic palindromic sequence PCR,REP-PCR),BOX-PCR标记及肠炎沙门氏菌重复序列PCR标记(Salmonella serotype Enteritidis repeat element,SERE-PCR)。ERIC序列,即肠杆菌基因间保守重复序列,长度为126bp,在不同细菌中的分布位置及拷贝数不同[11],经凝胶电泳产生特异图谱;很多微生物基因组DNA中包含贯穿整个基因组的高度重复短DNA序列,一般1～10bp,这些短串重复序列可区分到种或者菌株的水平。基于这些序列进行PCR扩增的方法就叫REP-PCR[12]。BOX片段是另一个原核生物基因组重复序列,大小为154bp,由boxA(57bp)、boxB(43bp)和boxC(50bp)3种不同的亚单位组成,其中只有boxA存在菌属、种、株水平的分布差异及表现出多拷贝和高保守性[13]。SERE与ERIC相似,为肠炎沙门氏菌重复序列,并广泛存在于细菌及古菌基因组中[14]。

RAPD技术操作简便,无须专门设计引物,没有种属限制,无须知道样本序列信息。为确保退火时双链的稳定性,引物G+C含量应>40%。虽然RAPD技术本身耗时短成本低,但在分析前,往往需要筛选大量的引物[15]。对实验条件敏感,重复性和稳定性差。可通过优化反应条件或结合序列特征化扩增区域标记技术(Sequence Characterized Amplified Region,SCAR)来克服此缺点[16-17]。ERIC技术与普通RAPD技术相比,引物长度长,退火温度高于52℃,因此图谱稳定,重复性高。有学者采用传统RFLP、RAPD及核糖体分型(Ribotyping)技术,比较脑脓肿患者及其牙周袋中星座链球菌的遗传多态性,传统RFLP分辨率最差且产生条带多不便于后续分析,另外两种技术结果相似[18-19]。采用RAPD及RiboPrinter核糖体分型系统对乳杆菌属内种间鉴定时,认为RAPD的敏感性较高,但实验步骤较复杂耗时较长。有学者用BOX-、ERIC-和REP-PCR对同一样本分别进行指纹分析,三者结果相似度很高,但想得到更精细的系统进化树,可将三者联合应用[20]。还有学者首次采用ERIC技术对具核梭杆菌种内株间鉴定,并与AP技术相对比,发现两者的分辨率均较高[21]。除此以外,利用分子标记技术对凝固酶阴性葡萄球菌菌种鉴定,并将tDNA-PCR及ERIC-PCR两种分子生物学方法的鉴定结果与传统的Auto Scan-4微生物分析仪和API Staph鉴定系统进行比较,一致率为95%[22]。用ERIC-、REP-、SERE-及BOX-PCR对草绿色链球菌进行属内种间及种内株间鉴别时发现,前三者所得结果非常相似,而BOX-PCR不能检测出口腔链球菌,因此没有进行进一步的比较。同时认为,BOX-PCR适合于革兰氏阴性细菌的种水平鉴定,前三者适用于革兰氏阳及阴性细菌的株水平鉴定, 但不适用于种水平鉴定[23]。

6 扩增片段长度多态性标记技术

扩增片段长度多态性标记技术(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)为限制性酶切片段的选择扩增来显示片段多态性的方法。具体步骤为基因组DNA经限制性内切酶双酶切后,形成分子量大小不等的限制性片段,再将双链人工接头(Artificial adapter)连接在黏性末端,形成一个带接头的特异片段,并作为PCR的模板,扩增片段电泳形成特异性图谱[24]。

AFLP综合了PCR及RFLP的优点,无须预知样本基因组信息。DNA用量少,可靠性好,分辨率高,重复性高。但该技术费用昂贵,过程复杂,对技术操作人员的技术水平要求较高,扩增时可能产生假阴性及假阳性结果。AFLP的核心问题在于限制性内切酶的选择,研究发现EcoRI-MseI 和 ApaI-TaqI 非常适合于G+C含量较低和较高的菌种。对含量在40～50mol %的菌种,可用HindⅢ-TaqI组合。AFLP在区分缘菌株方面也非常具有潜力。有学者选用黄单胞菌属180株菌株,对AFLP、rep-PCR(BOX、ERIC、REP)及DNA-DNA杂交三种细菌分类方法比较,结果表明三者有较好的一致性[20]。

7 定量逆转录PCR

定量逆转录PCR(Reverse transcriptase PCR,RT-PCR)包括两个基本过程:mRNA的反转录和定量PCR。定量PCR的基本原理是在PCR扩增的指数期,产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系。因此可根据PCR扩增产物的量确定目标基因的表达水平。根据定量测定的时间,定量RT-PCR可分为实时定量RT-PCR(Real time quantitative,real-time RT-PCR)和终点定量RT-PCR(End point measure quantitative,RT-PCR)。real-time RT-PCR具有全封闭、自动化、不需凝胶电泳、重复性好及精确定量等优势,在口腔微生物领域被广泛应用。但PCR前核酸的提取效率,反应过程中任一因素的细微变化均可导致最终结果的巨大差异[25]

8 荧光原位杂交技术

荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)基本原理是用荧光材料将一种核酸单链标记成探针,在微生物核酸的原有位置进行杂交。采用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)和落射荧光显微镜(EFM)获得微生物在形态学、数量及空间分布等方面的信息,对样品进行定性定量分析[26]。

FISH技术操作简便,实验成本相对较低。但探针接近靶区的能力,探针的敏感性、特异性和稳定性等问题还需要进一步改善。除此以外,有学者将扫描电镜(SEM)、传递电子显微镜(TEM)与FISH-CLSM联合应用,更好地显示出菌体—细胞外基质—菌体所处环境三者本身的结构及相互的空间结构关系[27-28]。微观放射自显影集成技术(Microautoradiography fluorescence in situ hybridization,MAR-FISH)还能反映出不同微生物的生物代谢情况;酪胺信号放大荧光原位杂交技术(Tyramide signal amplification fluorescence in situ hybridization,TSA-FISH)可以显著增强信号强度提高灵敏度,并缩短探针长度[29]。TSA还可与基因芯片技术合用,起到与TSA-FISH相似的信号增强作用。

9 抑制消减杂交技术

抑制消减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)是一种比较不同群体中差异表达基因的技术。首先将待测样本cDNA(如高毒力菌株)和驱逐样本cDNA(如低毒力菌株)分别用同一种限制性内切酶消化,再将两者变性后经过两次杂交复性,使差异表达的序列片段得到富集。通过第一轮具有抑制作用的PCR扩增,使共同表达序列得到抑制,差异表达的序列片段得到显著扩增,再经过第二轮巢式PCR,极大地提高了差异表达的目片段的特异性及丰度。

SSH技术可检测低丰度表达基因,假阳性率低,高敏感性及一次反应可检出几十或成百差异表达的基因。但需要几微克mRNA,同时两样本之间要有相似的遗传背景[30]。

10 基因芯片技术

基因芯片技术(Gene chip)是将DNA探针列阵固定于固相基质上,将待测样品的DNA/RNA片段用荧光或其他方法标记后作为靶分子,与基因芯片上的探针列阵杂交。由于列阵中特定位置上的核苷酸序列是已知的,所以对每一位点上的荧光强度进行检测,即可对样品的遗传信息进行定性定量分析。杂交信号常用激光共聚焦扫描显微镜检测,并用专用软件记录分析后输出结果。

该技术直接以序列差异作为标记,具有高通量、并行性及自动化等优点,特别在基因相互作用和调控关系的研究方面具有独特优势,被认为是应用前景最好的遗传标记技术。但成本昂贵、影响杂交动力学的因素等还有待深入研究。目前有学者应用肽核酸(Peptide nucleic acid,PNA)代替DNA制作探针以解决杂交时芯片上的探针自身形成二级甚至是三级结构的问题。同时认为,PNA-DNA的结合比DNA-DNA的结合更加牢固[31]。还有学者将SSH技术与基因芯片相结合,弥补互相缺陷。SSH能够有效筛查低丰度差异表达的基因,还能分离和鉴定未知基因,而这些是基因芯片无法完成的。差异表达基因若通过Northern blot来验证,其工作繁重且效率低。基因芯片技术可以弥补这点不足。除此以外,口腔致病菌生物信息资源库(The Bioinformatics Resource for Oral Pathogens,BROP),可向研究者提供芯片序列等相关信息。

综上所述,口腔微生物在维持口腔健康方面发挥着重要作用。一系列新型分子生态学技术的引用,为基因层面上深入分析口腔微生物提供了从整个群落—属—种—株—特定基因鉴定和表达及与宿主相互关系的研究方法,极大地促进了口腔微生物学的发展。这些方法不仅可对微生物进行定性定量分析,还可进行形态学观察,甚至是微生物群落生态变化的功能性试验,监控菌落生态系统的动态变化,了解微生物与宿主之间的相互关系。其中的许多试验方法不仅特异性高,高通量,而且操作简便,节省时间。但每种方法还存在各种问题,适用范围也有所不同,需根据实验目的选择合适的实验方法。