谭燕杰，石郎天，姚勇刚△

（1. 湖南中医药大学，湖南 长沙 410208； 2. 重庆市中医院，重庆 400011）

炎症性肠病（IBD）包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）［1］。近年来，IBD 在亚洲、欧美及中东地区的发病率不断上升，但目前仍缺少有效的治疗手段，导致IBD患者生活质量降低，社会负担加重［2-3］。IBD的病因尚未明确［4］，随着研究的不断深入，越来越多的研究表明肠道黏膜屏障的破坏与IBD 的发病密切相关［5-6］。ZO - 1 和Occludin 蛋白为缝隙连接蛋白，在IBD 发病的病理生理过程中，通过与其他蛋白相互作用，形成了上皮细胞之间的紧密连接，从而发挥维持上皮屏障完整性的关键作用［7-8］。去氢骆驼蓬碱是药用植物骆驼蓬种子的提取物，在国内及中东部分地区已有上千年的药用历史。现代研究表明，该成分具有抗炎性反应、抗病毒、抗感染、抗氧化等作用［9］，但其对IBD 的作用尚未明确。本研究中探讨了去氢骆驼蓬碱对IBD模型小鼠肠道组织黏膜屏障的防护作用，从而为开发IBD治疗手段提供新思路。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：KH - BL 型包埋机（湖北孝感阔海医疗科技有限公司）；YD - 315 型石蜡切片机（金华市益迪医疗设备有限公司）；LTP - 400 型脱水机（金华市华速科技有限公司）；Bio - rad 蛋白电泳转印套装1658029、Biorad Powerpac HC 164-5052型电泳仪（美国Bio-rad公司）。

试药：去氢骆驼蓬碱（批号为HY-N0737A）、蛋白酶抑制剂（批号为HY-13259），均购自美国MCE公司；2%硫酸葡聚糖钠（DSS，美国MP Biomedicals 公司，批号为0216011080）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（批号为C0105M）、细胞裂解缓冲液（批号为P0013B），均购自上海碧云天生物技术股份有限公司；戊二醛（梯希爱<上海>化成工业发展有限公司，批号为G0067）；硝酸纤维素滤膜（美国PALL 公司，批号为P - N66485）；ZO-1 抗体（批号为21773-1-AP）、Occludin 抗体（批号为27260-1-AP）、GAPDH 抗体（批号为60004-1-Ig），均购自武汉三鹰生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G（赛默飞世尔科技< 中国>有限公司，批号为A-11034）；转印模块（美国Biorad公司，批号为1658029）。

动物：C57BL/6J 小鼠，64 只，雄性，2月龄，体质量（22±2）g，于温度25 ℃，相对湿度40%，12 h/12 h 明暗交替环境下适应性喂养1周。均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验动物生产许可证号SCXK（沪）2022-0007。动物饲养于重庆市中医院动物实验室，实验期间小鼠自由进食饮水。本研究经重庆市中医院实验动物伦理审查批准（批件号2023-DWSY-TYJ）。

1.2 方法

1.2.1 分组、建模与给药

将64 只小鼠随机分为空白对照组（等体积水）、药物对照组（0.05 mg/mL去氢骆驼蓬碱）、模型组（等体积水）和药物观察组（0.05 mg/mL去氢骆驼蓬碱），各16只。在小鼠饮水中添加2%的DSS，连续喂养7 d，以复制IBD小鼠模型；空白对照组和药物对照组以水喂养。建模成功后，各组小鼠予相应药物或水，连续4 d。

1.2.2 体质量及生存率

每组取10 只小鼠，分别于建模第0～7 天称定体质量，观察各组小鼠建模第0～11 天的生存率，并进行组间比较。

1.2.3 结肠长度及病理学评分

每组取6只小鼠，收集结肠组织，测量其长度，并固定，将标本置4%多聚甲醛24 h，随后脱水、石蜡包埋和切片（厚4 μm），HE 染色，显微镜下观察。基于组织损伤参数（腺体增生、上皮损伤和水肿程度）和炎性参数（单核细胞、多形核细胞、淋巴细胞和浸润位置）进行评分。评分范围为0～3分和0～4分，对于组织损伤参数分别对应不存在、轻微、中度、严重，对于炎性参数分别对应不存在、黏膜、黏膜下层、全层（肌层和浆膜受累）、弥漫性。

1.2.4 蛋白表达

采用Western blot法。取小鼠结肠组织，加入液氮研磨，加入细胞裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂，研成匀浆，冰上静置5 min，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，随后提取蛋白。采用BCA 法进行蛋白定量，随后进行SDS -PAGE、转膜、封闭，用5% 脱脂奶粉稀释的ZO - 1抗体（1∶500）、Occludin 抗体（1∶800，V/V）4 ℃下孵育过夜，TBST 缓冲液洗膜3 次，每次10 min，用5%脱脂奶粉稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G（1∶5 000，V/V），室温下孵育60 min，TBST 再次洗膜3次，每次10 min，采用化学发光法显影。使用Image J软件计算蛋白的相对表达量。

1.3 统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0 统计学软件分析。生存分析使用对数秩（Mantel- Cox）检验。采用Shapiro- Wilk检验判断数据是否符合正态分布，符合且方差齐时行双侧、未配对t检验。对于假定具有相等方差和正态分布的3 组及以上数据，使用单因素方差分析（ANOVA），再使用Bonferroni 事后检验进行多重比较。P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生存率、体质量及结肠长度

与模型组比较，药物观察组小鼠的生存率明显升高，体质量变化率明显减小，结肠长度明显增加（P<0.05）。详见图1。

注：*P < 0.05，**P < 0.01。图2、图3同。A. 生存曲线 B. 体质量 C. 结肠长度图1 小鼠生存曲线、体质量及结肠长度Note：*P < 0.05，**P < 0.01（for Fig.1 - 3）.A.Survival curve B.Body mass C.Colon lengthFig.1 Survival curve，body mass and colon length of mice

2.2 肠道组织病理学评分及形态

与空白对照组比较，模型组小鼠病理损伤明显加重，结肠黏膜和黏膜下层出现上皮损伤，炎性细胞增多，部分细胞核出现溶解，且病理学评分明显升高（P<0.05）；与模型组比较，药物观察组小鼠病理损伤程度明显减轻，结肠黏膜和黏膜下层上皮损伤明显减轻，炎性细胞浸润明显减少，且病理学评分明显降低（P< 0.05）。详见图2。

a1. 空白对照组 a2. 药物对照组 a3. 模型组 a4. 药物观察组A. 显微镜图（HE，× 100） B. 数据统计图2 病理组织学及病理组织评分a1.Blank control group a2.Drug control group a3.Model group a4.Drug observation groupA.Microscopic images（HE，× 100） B.Data statisticsFig.2 Pathological histology and pathological score

2.3 ZO-1 和Occludin 蛋白

与空白对照组比较，模型组小鼠ZO-1和Occludin蛋白表达水平均明显降低（P< 0.05）；与模型组比较，药物观察组小鼠ZO-1 和Occludin 蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。详见图3。

3 讨论

近年来已有大量研究广泛探讨了IBD 的发病机制和治疗策略。既往研究表明，免疫系统异常激活、遗传易感性、肠道菌群失调、饮食相关因素及环境因素等多种因素与IBD 的发病相关［8，10］。传统疗法中使用的免疫抑制剂、益生菌、生物制剂等，在部分患者中可能表现出限制性或不良反应［11-13］，故寻找新的治疗策略以改善IBD患者的预后尤为重要。

近年来，越来越多的研究关注了天然产物和草药中的活性成分，探索其对IBD的潜在疗效［14-15］。去氢骆驼蓬碱具有潜在的药用价值，在一些实验模型中显示出对炎性疾病具有抗炎和免疫调节作用［16-17］。本研究结果显示，与模型组比较，药物观察组小鼠的存活率显著升高，结肠长度明显增加，IBD 相关的病理组织学明显改善，进一步强调了其有益效果。表明去氢骆驼蓬碱可能作为治疗IBD的潜在药物。

IBD 的病理生理特点为肠道黏膜屏障的破坏［8，18］，导致肠道内微生物易穿越，继而引发炎性反应。肠道黏膜屏障的破坏可能涉及黏膜上皮细胞的改变及缝隙连接蛋白的异常表达［19］。既往研究证实，缝隙连接蛋白（如ZO - 1，Occludin 等）在维持肠道屏障完整性方面十分重要，其水平失调与IBD 的发病有关［20］。本研究结果表明，去氢骆驼蓬碱有效地调节了肠道组织中缝隙连接蛋白ZO - 1 和Occludin 的表达，提示其可能通过增强肠道屏障功能和减少黏膜通透性来发挥作用。去氢骆驼蓬碱改善肠道屏障功能的能力在IBD 的背景下尤为重要，因为黏膜屏障的破坏会促进IBD 的发展并加剧炎性反应。通过恢复肠道屏障的完整性，去氢骆驼蓬碱有可能减轻肠腔抗原和病原体对黏膜的渗透，病理组织上表现为结肠黏膜和黏膜下层上皮损伤减轻，炎性细胞浸润减少，从而减轻IBD 特有的炎性反应。

去氢骆驼蓬碱对缝隙连接蛋白的影响还表明了其在治疗IBD外对胃肠道健康的更广泛意义。考虑到肠道屏障完整性在维持肠道稳态和预防各种胃肠道疾病方面的核心作用，去氢骆驼蓬碱可能在治疗与黏膜屏障功能失调有关的多种疾病方面具有潜力。

综上所述，去氢骆驼蓬碱对IBD 模型小鼠的肠道屏障具有一定防护作用，其机制可能为提高ZO - 1 和Occludin 蛋白表达水平。未来仍需进一步明确该成分如何调控缝隙连接蛋白，同时需进一步研究其完整的治疗潜力。