王卓萍，胡小燕，胡慧佳，张燚超，金军

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种常见的呼吸系统疾病，随着疾病进展，患者肺功能逐渐下降，导致呼吸困难、持续咳嗽和反复急性加重[1]。由于COPD 患者的肺部环境易于细菌和真菌定植，因此更容易发生各种呼吸道感染。侵袭性肺曲霉菌病（invasive pulmonary aspergillus，IPA）是一种由曲霉菌引起的严重肺部感染，在COPD患者中的发生率逐年上升，其临床表现与其他呼吸道感染相似，但进展迅速，若不及时诊断和治疗，可能导致患者死亡[2]。目前，IPA 的诊断主要依赖临床表现、影像学检查和微生物学检测等，传统的微生物学检测方法，如直接镜检和培养，虽然诊断准确率较高，但耗时较久[3]。近年来，宏基因二代测序（mNGS）技术逐渐应用于各种感染性疾病的诊断，可快速、准确地检测出样本中的微生物DNA，为临床诊断提供高效的工具[4]。半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）试验和血清烟曲霉特异性抗体检测也是诊断IPA 的常用工具，本研究旨在探讨mNGS技术联合GM 试验、血清烟曲霉特异性抗体检测对COPD 合并IPA 的诊断价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采用前瞻性研究，纳入2020 年8 月至2023 年8 月杭州市第九人民医院收治的96 例COPD患者。纳入标准：（1）符合COPD 诊断标准[5]；（2）存在疑似IPA 的临床表现（如发热、持续咳嗽、胸痛、血痰等）；（3）胸部影像学检查显示肺部浸润、空洞形成等可能与IPA 相符的表现；（4）临床资料完整。排除标准：（1）已明确诊断为肺结核、肺癌等其他呼吸系统疾病；（2）有严重肝肾功能障碍、已知其他真菌感染。本研究获得杭州市第九人民医院伦理委员会批准，所有研究对象均同意参加本研究并签署书面知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 mNGS检测 从患者的支气管肺泡灌洗液中提取总DNA，采用QIAamp DNA Mini Kit 进行DNA 提取；使用专门针对微生物的16S rRNA 引物进行PCR扩增，PCR 反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，35 个周期，55℃退火30s、72℃延伸1min，最后72℃延伸7min。使用IlluminaMiSeq 平台进行测序，使用QIIME 2 软件进行数据分析，与NCBI 微生物数据库进行比对，在样本中检测到曲霉菌DNA序列，且其在所有微生物中的相对丰度超过1%，判定为阳性。

1.2.2 GM 试验 从患者血液中提取血清，存储于-20℃；采用PlateliaAspergillusGM试剂盒，按照厂家说明书进行操作，通过酶标仪读取450nm的吸光度值。

1.2.3 血清烟曲霉特异性抗体检测 从患者血液中提取血清，存储于-20 ℃；使用烟曲霉IgG ELISA试剂盒，将样本加入预先包被有烟曲霉抗原的酶标板孔中，孵育1 h；采用洗涤缓冲液洗涤3 次，去除未结合的物质，加入与IgG抗体结合的酶标记二抗，孵育30 min，重复洗涤步骤，加入TMB底物，孵育20min，然后加入停止液；通过酶标仪读取450 nm 的吸光度值，使用标准曲线来确定抗体浓度。

1.3 COPD合并IPA的诊断标准 参照欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组（EORTC/MSG）的共识标准[6]，（1）临床表现：持续发热且广谱抗生素治疗无反应，存在呼吸困难、持续咳嗽、胸痛及血痰；（2）影像学检查：胸部CT 显示“新月体”征、“空洞”形成、“卫星病灶”；（3）微生物学证据：从呼吸道分泌物或肺组织中直接观察到曲霉菌的分枝菌丝，从肺组织或支气管肺泡灌洗液中分离出曲霉菌；（4）组织病理学证据：肺组织活检发现曲霉菌侵袭性生长，如曲霉菌的菌丝穿透肺泡壁、出现组织坏死。

1.4 统计方法 采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，采用独立样本t 检验；计数资料采用2检验；联合检测中一项阳性则结果为阳性，绘制ROC曲线分析各检测方法的诊断价值。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 根据诊断标准，最终96例患者中合并IPA组40例，非IPA组56例，IPA组男24例，女16例；年龄45～78岁，平均（62.3±8.5）岁；COPD病程3～15年，平均（9.45±3.58）年。非IPA组男34例，女22例；年龄43～77岁，平均（60.1±7.9）岁；COPD 病程2～14年，平均（8.76±3.37）年。两组一般资料差异无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2 mNGS 检测结果 mNGS 检出阳性44 例，其中真阳性36例，阴性52例，其中真阴性48例，见表1。

表1 mNGS 检测结果 例

2.3 两组血清GM 值及烟曲霉IgG 抗体水平比较IPA 组血清GM 值及烟曲霉IgG 抗体水平均高于非IPA 组（均P ＜0.05），见表2。

表2 两组血清GM 值及烟曲霉IgG 抗体水平比较

2.4 血清GM 值及烟曲霉IgG 抗体水平对IPA 的诊断价值分析 ROC曲线显示，血清GM值、烟曲霉IgG抗体水平诊断TPE的最佳截断值分别为0.64、77.32kAU/L，对应的AUC 分别为0.804、0.807，联合诊断AUC 为0.865，见表3。

表3 血清GM 值及烟曲霉IgG 抗体水平对IPA 的诊断效能

2.5 mNGS 联合GM 试验、血清烟曲霉IgG 抗体检测对IPA 的诊断效能 mNGS 联合GM 试验、血清烟曲霉IgG 抗体检测诊断IPA 的敏感度、特异度、准确度分别为96.88%、92.19%、93.75%，与最终诊断结果的一致性检验Kappa 值为0.86，见表4。

表4 mNGS 联合GM 试验、烟曲霉IgG 抗体检测对IPA 的诊断效能

3 讨论

IPA的临床表现多样且具有非特异性，临床确诊有一定难度，传统诊断方法如微生物培养和组织病理学检查耗时较长，可能导致诊断延迟而延误病情[7-8]。因此，寻找一种快速、准确的IPA 诊断方法，对于改善COPD 患者的疗效和预后具有重要意义。

mNGS是近年来迅速发展的一种高通量测序技术，其核心原理是通过对样本中的所有DNA进行测序，然后与已知的微生物数据库进行比对，从而实现对病原体的快速、准确鉴定[9-11]。在IPA 的诊断中，mNGS可在短时间内直接从患者样本中检测到曲霉菌DNA，从而为早期诊断提供依据[12]。本研究结果显示mNGS技术在IPA的诊断中敏感度高达90.0%，这是因为mNGS可在短时间内检测到大量微生物的DNA，且与传统微生物培养方法相比，mNGS不受微生物生长速度、培养条件等因素的限制，因此更为敏感。mNGS 单独诊断IPA 的特异度为85.7%，提示存在一定的假阳性率，可能原因是mNGS 检测的是曲霉菌DNA，而不是活菌，因此即使在没有活性感染的情况下也可能检测到曲霉菌的DNA，从而导致假阳性结果。此外，环境中的曲霉菌污染、样本处理过程中的交叉污染等因素也可能导致假阳性结果。

GM 是曲霉菌细胞壁的组成部分，在曲霉菌的生长和复制过程中会释放到体内，因此其在血清中的存在与曲霉菌的活性侵袭有关，且血清中的GM 水平在感染早期显著升高，因此GM 试验常被用作IPA 的早期和快速诊断工具[13]。本研究结果显示IPA 组血清GM 值高于非IPA 组，与文献[14]报道结果一致。ROC曲线分析显示，血清GM 值对IPA 诊断的最佳截断值为0.64，单独诊断特异度高但敏感度较低，原因是GM试验在感染初期或菌量较低的情况下容易出现假阴性。在免疫系统受到侵袭时，机体会产生特异性抗体来应对病原体感染，因此检测烟曲霉特异性IgG 抗体水平可提供患者免疫状态相关信息。本研究结果显示IPA组血清烟曲霉特异性IgG抗体水平高于非IPA组。IPA 通常病程较长，烟曲霉IgG 抗体水平的升高可能会持续较长时间，而不像一些其他免疫标志物（如C反应蛋白）那样迅速升高和下降，这也导致一些早期或轻度感染可能会漏诊[15]。本研究结果显示mNGS 技术、GM试验及血清烟曲霉IgG抗体检测三者联合诊断，敏感度、特异度、准确度均较高，与最终诊断结果一致性较好，原因是三种诊断方法各自具有其优点和局限，通过联合检测可互相弥补局限性，从而提高诊断敏感性。mNGS技术在早期感染就能检测到病原体，而早期感染可能在其他诊断方法中产生假阴性结果，但mNGS 可以更早捕获感染信号，同时也有助于确定治疗后是否存在潜在耐药或其他复杂情况；GM 试验和IgG 抗体检测早期敏感性较低，但可用于监测治疗效果或复发感染，三者联合诊断可减少漏诊或误诊的可能性。

利益冲突 所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明 王卓萍：实验操作、论文撰写；胡小燕、胡慧佳、张燚超、金军：数据整理、统计学分析