周 佳 余才贵 姜 楠 郭瑞强 曹 省

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）及其相关不良心血管事件的防治是一项重大的临床挑战。由于AS病理生理机制复杂，采用单一药物治疗往往效果不佳，联合治疗方式逐渐成为研究热点。免疫抑制剂雷帕霉素（rapamycin，RAP）具有独特的抗AS 作用，局部靶向给药可有效避免传统给药方式带来的全身不良反应。包覆血小板膜的纳米探针因其独特的靶向能力已成为靶向给药的重要载体之一，超声靶向微泡释放 技 术（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）是一种安全有效的物理靶向方法，其在靶向递药、基因转染及溶栓治疗等方面均有广阔的应用前景。本实验通过将RAP 的药理作用、纳米探针的增容作用、血小板膜的生物学作用和UTMD 的物理效应相结合，制备血小板膜仿生纳米靶向探针（platelet membrane biomimetic targeting nanoprobes，PLT-RAP@NPs），并评价其在体外的免疫逃逸、靶向和黏附能力，以及联合UTMD后的载药控释情况，旨在探索一种治疗AS的新策略。

材料与方法

一、实验材料

1.主要试剂：聚乙烯醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA，聚合比例50∶50，分子量13 000，美国Sigma-Aldrich 公司）；二氯甲烷（上海阿拉丁生化科技股份公司）；PBS 缓冲液、乙腈（美国ThermoFisher Scientific 公司）；RAP（大连美仑生物技术有限公司）；RAW 264.7巨噬细胞、血管平滑肌细胞和人脐静脉内皮细胞（美国ATCC 公司）；氧化型低密度脂蛋白（广州奕源生物科技有限公司）；DAPI、DiI和CCK-8溶液（上海碧云天公司）；注射用六氟化硫微泡（SonoVue，意大利Bracco公司）。

2.主要仪器：超声波细胞破碎仪（VCX150，美国Sonics&Materials 公司）；高速冷冻离心机（5804/R，德国Eppendorf公司）；离心机（湖南力辰仪器公司）；超声浴波仪（FS30D）和荧光显微镜（EVOS M5000）均由美国ThermoFisher Scientific 公司提供；纳米粒度电位仪（Zetasizer Nano ZS，英国Malvern 公司）；透射电子显微镜（Tecnai G2 F20 S-TWIN，美国FEI 公司）；电动恒温磁力搅拌仪（常州国华电器公司）；超声空化仪（WED-100，深圳威尔德医疗公司）；多功能酶标仪（TECAN M1000，瑞士TECAN公司）。

二、实验方法

1.PLT-RAP@NPs的制备

（1）单乳化- 溶剂挥发法合成纳米探针RAP@NPs：将100 mg PLGA 加入3 ml 二氯甲烷中，完全溶解成有机相后再加入RAP；将5 g 聚乙烯醇加入100 ml纯水得到5%聚乙烯醇溶液为外水相，4℃保存；冰浴下将有机相缓慢加入15 ml 外水相中，超声波乳化90 s（能量60%，工作5 s，间隔5 s）；将上述乳液用电动恒温磁力搅拌仪搅拌2～5 h 充分挥发有机溶剂，高速冷冻离心机离心10 min（4℃、10 000 r/min），弃上清液，沉淀即得到RAP@NPs。

（2）梯度离心-反复冻融法提取血小板膜囊泡：取小鼠静脉血离心5 min（室温、300 r/min），去沉淀分离红细胞与白细胞；然后将上清液再次离心5 min（室温、300 r/min）去沉淀，得到含血小板的血浆；将上清液离心4 min（室温、2000 r/min），沉淀物即为血小板；将蛋白酶抑制剂溶于PBS 缓冲液（比例1∶100），加入乙二胺四乙酸，使其浓度为1 mmol/L；将分离的血小板用PBS 缓冲液重悬，-80℃冷冻。室温下重复冷冻、解冻3 次；PBS 缓冲液洗涤，高速冷冻离心机离心5 min（4 ℃、21 000 r/min），重复3次，超声浴波仪振荡5 min，即得到血小板膜囊泡，-80℃保存。

（3）超 声 震 荡 法 制 备 PLT-RAP@NPs：取RAP@NPs用PBS缓冲液重悬，加入过量血小板膜囊泡后应用超声浴波仪振荡5 min；高速冷冻离心机离心10 min（4℃、12 000 r/min），去上清液后沉淀即得到PLT-RAP@NPs，4℃保存。

2.PLT-RAP@NPs的表征测定

将制备好的RAP@NPs、PLT-RAP@NPs 分别用PBS缓冲液重悬，观察其外观，使用纳米粒度电位仪检测RAP@NPs、PLT-RAP@NPs 粒径和表面电位，均重复3次取平均值。应用透射电子显微镜观察其微观形态，然后分别置入10%胎牛血清和PBS缓冲液中，37℃恒温培养箱孵育，连续1 周取纳米溶液使用纳米粒度电位仪检测粒径和表面电位，观察其稳定性。

3.PLT-RAP@NPs中RAP的包封率和载药率计算

取适量RAP 用乙腈溶解，稀释成浓度分别为（1 μg/ml、2 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml、500 μg/ml、1000 μg/ml 的标准溶液，采用高效液相色谱法建立标准曲线。再将3 mg、5 mg、10 mg RAP 分别加入100 mg PLGA 及血小板膜囊泡制备PLT-RAP@NPs，将其溶于1 ml 乙腈，离心取上清液复溶后10 μl 上样分析，根据标准曲线获得包载的RAP重量，计算包封率和载药率。

4.PLT-RAP@NPs的体外寻靶实验

（1）细胞培养和泡沫细胞制备：RAW 264.7巨噬细胞培养采用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基；人脐静脉内皮细胞培养采用含100 U/ml 链霉素和0.01%青霉素的EBM-2 内皮生成培养基，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。泡沫细胞的制备：待RAW 264.7 巨噬细胞生长密度为50%时，使用浓度为50 μg/ml 的氧化型低密度脂蛋白处理24 h，进行泡沫化后应用油红O 脂肪染色鉴定巨噬细胞是否成功转化为泡沫细胞。泡沫细胞制备成功的标准为油红O染色显示细胞体积增大，呈圆形、短梭形或不规则形，胞浆内可见大量红色或暗红色圆形脂滴。

（2）荧光标记的纳米探针DiI@PLGA、PLTDiI@PLGA 的制备：方法同RAP@NPs 和PLTRAP@NPs 制备，将其中RAP 更换成0.1 wt% DiI 荧光染料，即可制备荧光标记的纳米探针DiI@PLGA 和PLT-DiI@PLGA，用于模拟RAP@NPs和PLT-RAP@NPs进行体外寻靶实验的荧光检测。

（3）体外巨噬细胞吞噬实验：将RAW 264.7 巨噬细胞接种于12 孔板中，在37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24 h；向培养板中分别加入DiI@PLGA（DiI@PLGA组）和PLT-DiI@PLGA（PLT-DiI@PLGA组），每组3 个复孔，孵育2 h 后PBS 缓冲液洗涤；然后多聚甲醛固定30 min，PBS 缓冲液洗涤3 次；DAPI 溶液染色10 min 后，吸去多余DAPI，PBS 缓冲液洗涤3 次；使用荧光显微镜观察两组细胞荧光强度。

（4）体外泡沫细胞摄取实验：于制备成功的泡沫细胞中分别加入DiI@PLGA（DiI@PLGA 组）和PLTDiI@PLGA（PLT-DiI@PLGA 组）；其余步骤同体外巨噬细胞吞噬实验。

（5）体外内皮细胞黏附实验：先将人脐静脉内皮细胞均匀铺于12孔板中，在37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24 h贴壁；当细胞浓度为80%～90%时，用100 ng/ml肿瘤坏死因子-α 刺激2 h，上调血管性假血友病因子（vWF）表达，再分别加入PBS 缓冲液（PBS 组）、DiI@PLGA（DiI@PLGA 组）、PLT-DiI@PLGA（PLTDiI@PLGA组）；其余步骤同体外巨噬细胞吞噬实验。

5.细胞增殖-毒性实验

采用CCK8 法进行细胞增殖-毒性实验。将RAW 264.7 巨噬细胞和血管平滑肌细胞分别接种于96 孔板中孵育24 h，于游离RAP、RAP@NPs和PLT-RAP@NPs中加入10 μl 不同浓度RAP（3.00 μg/ml、6.25 μg/ml、12.50 μg/ml、25.00 μg/ml、50.00 μg/ml、100.00 μg/ml），每一浓度设置3 个复孔，以PBS缓冲液为参照，再孵育48 h。加入10 μl CCK-8 溶液，孵育2～4 h 后应用多功能酶标仪检测450 nm处吸光度，细胞与RAP混合测得的吸光度记为ODt，细胞与PBS 缓冲液混合测得的吸光度记为ODc，仅PBS缓冲液测得的吸光度记为ODb，计算细胞增殖活性，公式为：细胞增殖活性=（ODt-ODb）/（ODc-ODb）×100%。

6.PLT-RAP@NPs联合UTMD的体外药物控释实验

采用体外透析法和高效液相色谱法观察PLTRAP@NPs 包载药物RAP 的控释情况。按以下分组进 行 实 验：RAP@NPs 组（10 mg/ml、1.0 ml）、PLTRAP@NPs 组（10 mg/ml、1.0 ml）、RAP@NPs+SonoVue+UTMD 组（其 中RAP@NPs 20 mg/ml、0.5 ml，SonoVue 0.5 ml）、PLT-RAP@NPs+SonoVue+UTMD 组（其 中PLT-RAP@NPs 20 mg/ml、0.5 ml，SonoVue 0.5 ml）。将上述各组溶液分别装入透析袋中，用含20 ml PBS 缓冲液的玻璃瓶密封，置于摇床中以37℃、100 r/min 的速度摇晃，后两组取样前应用超声空化仪（频率1 MHz，声强2 W/cm2，占空比40%）辐照30 s，分别于5 min、10 min、20 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h取出0.5 ml释放溶液，同时补充相同体积的PBS 缓冲液。释放溶液中的RAP 浓度采用高效液相色谱法定量测定，计算各组累积药物释放量，并绘制曲线图。

三、统计学处理

结 果

一、RAP@NPs及PLT-RAP@NPs的表征

透射电子显微镜下RAP@NPs 呈圆形，均匀分布（图1A），平均粒径（256.47±5.41）nm，平均表面电位-（18.57±0.84）mV；PLT-RAP@NPs 呈球形，大小均匀，表面覆盖一层薄膜、“核-壳”结构清晰（图1B），平均粒径（286.83±5.25）nm，平均表面电位-（15.60±5.04）mV。在10%胎牛血清和PBS 缓冲液中分别储存1 周后，RAP@NPs的平均粒径和平均表面电位分别为（247.52±7.21）nm、（250.36±6.95）nm 和-（17.36±2.19）mV、-（17.28±1.64）mV，PLT-RAP@NPs的平均粒径和平均表面电位分别为（278.45±8.29）nm、（288.17±9.35）nm和-（14.28±3.94）mV、-（14.07±4.52）mV，其粒径和表面电位相对稳定，变化均小于10%。

图1 RAP@NPs和PLT-RAP@NPs透射电子显微镜下观（标尺为100 nm）

二、PLT-RAP@NPs中RAP的包封率和载药率

由3 mg、5 mg、10 mg RAP制备成的PLT-RAP@NPs包封率分别为60.35%、45.92%、41.03%，载药率分别为2.18%、2.68%、2.97%。

三、PLT-RAP@NPs的体外寻靶实验

体外寻靶实验结果显示，巨噬细胞吞噬实验中DiI@PLGA 组橙红色荧光强度约为PLT-DiI@PLGA 组3 倍（图2A）；泡沫细胞摄取实验中PLT-DiI@PLGA 组橙红色荧光强度约为DiI@PLGA 组4 倍（图2B）；内皮细胞黏附实验中PLT-DiI@PLGA 组橙红色荧光强度较DiI@PLGA组增强（图3）。

图2 PLT-RAP@NPs体外寻靶实验荧光显微镜下观（标尺为75 μm）

图3 人脐静脉内皮细胞黏附PLT-RAP@NPs体外寻靶实验荧光显微镜下观（标尺为10 μm）

四、细胞增殖-毒性实验

细胞增殖-毒性实验结果显示，随着RAP 浓度增高，游离RAP 中细胞增殖活性呈阶梯式下降；而RAP@NPs 和PLT-RAP@NPs 中细胞增殖活性变化较小。见图4。

图4 不同浓度RAP下的体外巨噬细胞（A）和血管平滑肌细胞（B）增殖活性图

五、PLT-RAP@NPs 联合UTMD 的体外药物控释实验

体外药物控释实验结果显示，各组纳米靶向探针中的RAP 均缓慢释放，72 h 后RAP@NPs 组和PLTRAP@NPs 组累积药物释放量分别为42.12% 和33.74%，联合UTMD 后累积药物释放量分别提升至75.57%和67.54%。见图5。

图5 各组体外累积药物释放的曲线图

讨 论

心血管疾病是累及人类健康的重要问题之一，其导致的高致残率和高死亡率造成了巨大的社会经济负担。AS是心血管疾病的主要病理学因素，其是一种进行性、多因素、慢性炎症性疾病[1］。由于AS 病理生理机制复杂，目前临床对AS及相关不良心血管事件的防治仍是一项重大挑战，需不断促使临床医学、基础医学、医学影像学和纳米材料学交叉融合，探索新的治疗策略，以实现精准治疗[2］。研究[3］发现免疫抑制剂RAP 可通过介导抗感染、抗增殖、免疫调节和脂质调节等信号通路对AS产生多重效性，从而改善斑块成分、减少斑块面积、提高斑块稳定性，实现抗AS 作用。然而，由于药物在体内非靶向分布和不可控的释放特性，传统全身给药方式会导致剂量依赖性不良反应，如头痛、出血、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、间质性肺病等[3］。研究[4］发现斑块局部靶向给药可有效避免上述不良反应，RAP 涂层支架可减少血管炎症，防止血管成形后再狭窄[5］。Kilroy 等[6］采用血管内超声和装载RAP 的微泡联合进行局部药物递送，使治疗所需的RAP 剂量明显降低；Dou 等[7］成功制备基于乙酰化β-环糊精负载RAP 的纳米粒，发现其可显著减少AS斑块形成并能增强斑块的稳定性，较口服游离RAP效果更佳，提示RAP 持续靶向递送较传统口服给药方式具有更理想的抗AS效果。

纳米靶向递送给药技术可提高生物利用度、降低副作用，但存在被免疫系统视为“异己”成分而清除等问题[8］。既往实验[9］采用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修饰纳米探针表面，可以有效减少蛋白质吸附、降低内皮网状系统清除率、延长循环时间，但机体仍可以产生特异性PEG 抗体，存在被清除的风险[10］。有学者[11］提出从血细胞提取细胞膜来修饰包覆纳米粒，其治疗效果优于纯PEG 纳米载体。血小板膜包覆的纳米粒模拟血小板，赋予了血小板膜纳米探针天然靶向炎症、受损血管、肿瘤和病原体的病理生理亲和力[12］。Wei等[13］实验发现血小板膜纳米探针可与泡沫细胞、内皮细胞和胶原蛋白有效结合，具有良好的靶向性。Song等[14］成功制备了一种载RAP的血小板膜包覆的纳米探针，表现出对AS斑块的高亲和力和RAP在体内诱导巨噬细胞自噬的高效率。血小板膜仿生纳米靶向递送给药方式提高了药物的生物利用度和靶区域分布浓度，降低了免疫原性，可实现更好的生物相容性和安全性，在AS治疗中具有非常大的应用潜力。

为了证实血小板膜仿生纳米探针能伪装成内源性物质，抑制巨噬细胞识别与吞噬，产生免疫逃逸和增强泡沫细胞摄取，本实验依次应用单乳化-溶剂挥发法、梯度离心-反复冻融法和超声震荡法成功制备PLT-RAP@NPs，其呈球形，大小均匀，表面覆盖一层薄膜、“核-壳”结构清晰，平均粒径（286.83±5.25）nm，平均表面电位-（15.60±5.04）mV，稳定性好。当100 mg PLGA 负载3 mg RAP 时，PLT-RAP@NPs 包封率最高，为60.35%，载药率为2.18%。由于RAP@NPs 和PLTRAP@NPs均不含荧光基因，不能直接显示荧光强度，故本实验进一步将细胞与纳米探针共孵育，通过观测封装DiI染料的纳米探针DiI@PLGA和PLT-DiI@PLGA的荧光强度，分别替代RAP@NPs 和PLT-RAP@NPs，结果显示相较于DiI@PLGA，PLT-DiI@PLGA 可明显抑制巨噬细胞识别与吞噬，增强泡沫细胞摄取。血小板对斑块具有固有的亲和力，其在AS病变每个阶段的招募是由一些黏附分子与炎性内皮细胞、纤维蛋白、胶原蛋白及泡沫细胞相互作用导致[15］，但在高剪切力作用下，不足以使血小板黏附于胶原蛋白上，需有血小板膜糖蛋白（GP Ib）结合vWF介导参与。在受损血管处，GP Ib-vWF-胶原的结合使血小板牢固黏附于内皮下[16］。本实验采用肿瘤坏死因子-α 刺激人脐静脉内皮细胞高表达vWF，再与纳米探针共孵育，结果显示PLT-DiI@PLGA 可明显增强与人脐静脉内皮细胞高表达的vWF 结合，从而实现靶向黏附。细胞增殖-毒性实验结果显示，随着RAP 浓度增高，游离RAP 中细胞增殖活性呈阶梯式下降，对细胞增殖的影响最大；而RAP@NPs 和PLT-RAP@NPs 中细胞增殖活性变化较小，这是由于RAP@NPs 的纳米结构和PLT-RAP@NPs的血小板膜涂层可使RAP 缓慢释放，纳米药物温和的细胞毒性可减少RAP带来的全身不良反应。

UTMD 作为一种靶向递药技术，体内外实验[17-18］已证明其可以将药物或基因递送至目标组织，并诱导其在特定部位释放，从而实现靶向递送，是一种具有广阔应用前景的治疗策略，且具有无创、无辐射、低免疫原性、低毒性、安全性高、特异性强和可控性等优点[19］。本实验结果显示，PLT-RAP@NPs 联合UTMD后RAP 释放速率慢于RAP@NPs，与既往研究[20］结果相似。分析原因可能为血小板膜的包覆减缓了RAP释放，联合UTMD的空化效应随即发生微射流、切应力和冲击波等均可导致PLT-RAP@NPs 纳米探针外包膜破坏，提高RAP 释放效率。因此，PLT-RAP@NPs 一方面可以通过长效循环缓慢释放，降低循环中因游离药物浓度过高而产生的毒副作用，另一方面联合UTMD能提高局部药物浓度，为超声控释增效奠定基础。

综上所述，本实验成功制备PLT-RAP@NPs，其既可抑制巨噬细胞吞噬实现免疫逃逸，又可有效增强泡沫细胞摄取和内皮细胞黏附能力；PLT-RAP@NPs 联合UTMD 可实现超声靶向控释，为治疗AS 提供更高效、优化、安全的新策略。但本实验采用单乳化-溶剂挥发法和超声震荡法制备血小板膜仿生纳米探针，虽较其他制备方法简单、高效、易转化，但存在纳米探针粒径偏大，血小板膜涂层不均匀的情况，后续仍需进一步改进。