王松 韩贺舟 马秀岚

老年性聋又称年龄相关性听力损失(age-related hearing loss,ARHL),主要表现为隐匿性、缓慢进行性双侧感音神经性听力下降,可引起老年患者的交流障碍、认知改变、脱离社会等不良影响。随着研究的进展,人们认为离子通道异常、耳蜗突触病变、活性氧自由基、线粒体异常、激素作用、遗传因素等因素导致了老年性聋的发生,本文对这些发病机制进行总结,希望对老年性聋的预防、早期发现和早期治疗的研究提供参考。

1 离子通道异常

细胞内及细胞间离子的正常转运是毛细胞发育、维持细胞器功能和保持蜗内电位(endocochlear potential,EP)所必需的,各种离子通道出现异常而导致耳蜗传音感音系统发生功能障碍,是造成老年性聋的机制之一。

1.1Na+_K+_2Cl-协同转运蛋白 Na+_K+_2Cl-(NKCC)协同转运蛋白在人体中存在NKCC1和NKCC2两种亚型[1],耳蜗中的血管纹是一种产生富含K+的内淋巴液的双层上皮,NKCC1在血管纹中高度表达,参与调节耳蜗中阶内淋巴液的K+浓度进而维持蜗内电位的稳定[1,2]。Mutai等[3]曾观察到在人体中NKCC1相关基因的改变使得外淋巴液中的K+无法循环至血管纹,内淋巴体积减小,前庭阶与中阶间的前庭膜塌陷,毛细胞受损,导致严重的听力下降。有研究报道在衰老小鼠模型中,NKCC1的表达有所减少,听力有所下降[4],进一步验证了NKCC1与ARHL的关系。针对这一改变,已有研究证实应用醛固酮可维持NKCC1蛋白结构的稳定,可能是未来治疗ARHL的方向之一[4]。

1.2Na+_K+_ATP酶 Na+_K+_ATP酶在结构上由三种亚单位组成,分别是α、β和FXYD,目前已发现4种α亚型、3种β亚型和7种FXYD亚型[5]。既往认为耳蜗血管纹中有α1、β1和β2三种亚型表达[6],α1-β1间的结合广泛存在,通过将血管纹中K+逆浓度和电压泵入内淋巴中,保证了内淋巴液高K+低Na+的稳态和蜗内电位的稳定[7],以确保声信号的传导。研究表明,Na+_K+_ATP酶的表达会随着年龄的增长而减少。Ding等[6]在CBA/CaJ小鼠耳蜗中观察到,所有的Na+_K+_ATP酶亚单位在蛋白和基因两方面的表达均随年龄增加而减少;同时衰老小鼠中β1亚单位的二硫键被破坏,削弱了α1-β1之间的化学键,影响了α1-β1亚单位的正确组装,可能是导致ARHL的原因之一。最近的研究发现,α2亚型在耳蜗中也有广泛分布,其mRNA和蛋白表达随年龄增长而下调,导致低效率的K+循环进而影响其转运,造成内耳结构的损害和听力损失[8]。α2-Na+_K+_ATP酶可能是预防ARHL的潜在靶点。

1.3钾离子通道 在人体中,钾离子通道根据其不同的功能和结构分为四型:电压门控钾离子通道(Kv)、内向整流钾离子通道(Kir)、双孔钾离子通道(K2P)和配体门控钾离子通道(Kligand)。KCNQ是一个编码五种Kv7通道的基因家族,KCNQ4参与从外毛细胞排出K+的主要通道,保证K+循环[1,9]。毛细胞中Kv7.4的表达受损是造成听力损失的主要因素,在KCNQ4基因敲除的小鼠模型中,Carignano[9]发现外毛细胞数量在模型小鼠年轻时即有减少,年老时几乎全部消失,内毛细胞和螺旋神经细胞数量也逐渐减少;随着年龄的增长,细胞的丢失从耳蜗底部发展至顶端,由于耳蜗底部的基底膜振动主要感知高频声,因此这一发现也与ARHL患者高频听力首先受累的表现相符。Jung等[10]通过对293例人类胚胎的电生理评估,也发现KCNQ4基因突变可能与迟发性听力损失有一定的联系。

2 耳蜗突触病变

传统观点认为听力损失与毛细胞的破坏有关。然而,Parthasarathy等[11]在CBA/CaJ小鼠模型中发现内毛细胞与听神经纤维间突触数量随着年龄增加而减少,这种变化出现在毛细胞损失之前,人体尸体解剖也发现类似结果[12],因此提出听力损失的发生可能通过耳蜗突触病变(cochlear synaptopathy,CS)这一机制造成。带状突触是内毛细胞和螺旋神经节细胞间的重要结构,是听觉传导通路中第一个兴奋传入突触。在耳蜗突触病变这个过程中,突触数量减少,但并未发现毛细胞数量的改变[11],考虑这一机制在老年性聋的发生发展中起到了重要作用[13]。

在老年性聋的早期,耳蜗带状突触是主要的损伤部位[14]。通过对人类颞骨的观察发现,随着年龄的增长尽管毛细胞的数量维持正常,但螺旋神经节细胞的数量在逐渐减少[13],导致带状突触减少。耳蜗突触的减少可由噪声暴露导致[15],有人提出年龄相关的耳蜗突触病变是由于以往的噪声暴露造成的[16],而不是机体老化的结果。然而,在移除鼓膜的个体中,也出现了突触数量随年龄增加而减少的现象[17],Johannesen等[18]研究也说明年龄是耳蜗突触病变的因素之一,这表明噪声暴露不是耳蜗突触病变的必要条件,ARHL患者出现耳蜗突触病变可能是机体老化和噪声暴露共同作用的结果。

带状突触前膜含有大量谷氨酸盐神经递质,谷氨酸盐是人体中枢神经系统中的一种兴奋性神经递质,其神经毒性在耳蜗突触病变中也发挥一定作用。很多ARHL患者既往都有噪声暴露过多或微循环障碍,噪声造成的谷氨酸盐过多释放或缺血造成的谷氨酸盐摄取障碍会导致突触后膜去极化延长,致使大量离子涌入突触后神经元,由此产生的渗透不平衡导致突触后成分中的水分大量增加,导致急性肿胀和随后的细胞死亡,最终导致螺旋神经节细胞的损失[19]。内毛细胞中维持突触囊泡循环的神经递质转运系统很大程度上依赖于线粒体产生的ATP,在D-半乳糖诱导的衰老小鼠耳蜗中检测到线粒体DNA氧化损伤增加和ATP生成减少。因此,年龄相关的带状突触损伤可能由线粒体氧化损伤和随之而来的其他功能障碍所引起[14]。

3 活性氧自由基

线粒体的有氧代谢产生了大量的ATP,随之而来也产生了大量的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),ROS产生和清除之间的不平衡会导致氧化应激[20],ROS引起的氧化损伤已成为许多疾病的研究热点。在D-半乳糖诱导的ARHL小鼠模型中,线粒体超氧化物的水平增高,线粒体DNA突变增多,ATP水平和线粒体膜电位显著下降,而抑制氧化应激可以缓解听力损失的程度[21],表明ROS也可能是老年性聋发生的机制之一。

在耳蜗血管纹中,ROS会破坏一些重要的细胞成分,如核DNA、线粒体DNA、细胞膜和蛋白质等。随着年龄增长,ROS的产生逐渐增多,所造成的破坏逐渐积累,导致组织结构改变和功能障碍,听觉系统不同部位遭到损伤后将影响听力[22]。动物模型中氧化应激导致线粒体功能障碍,增加了线粒体外膜通透性,膜电位降低,线粒体释放凋亡诱导因子和细胞色素c进入胞浆,激活caspase-3并诱导凋亡,造成带状突触和毛细胞的丢失和变性[23]。研究表明,缺乏抗氧化基因的小鼠模型会表现出更加严重的ARHL[24,25]。

还有许多研究证明了ROS在ARHL发生中的作用。核因子E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)是细胞应对氧化应激过程中的关键转录因子,能够保持氧化与抗氧化间的稳态,同时通过调节细胞保护酶来抵御ROS所带来的损伤,听觉皮层中随年龄增长降低的Nrf2通路活性以及相关mtDNA的损伤是老年性聋听觉皮层老化的主要机制之一[26]。Cav1.3是一种电压门控Ca2+通道,介导Ca2+内流,细胞内Ca2+会削弱ROS带来的影响,Cav1.3数量随年龄增长而减少,Cav1.3敲除会导致细胞内ROS的灭活减少,促使细胞衰老和凋亡[27]。异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)是有氧代谢的重要元素,促进了NADPH和NADH的产生,这两种分子由于其抗氧化的性质对减少细胞的氧化应激起到了重要作用。在衰老小鼠中IDH表达有所减少,IDH2基因敲除的小鼠表现出NADPH产生减少,内耳中氧化应激负担加重,导致毛细胞和螺旋神经节细胞减少,促进ARHL的发生[28]。

在人体和动物试验中均发现抗氧化剂会延缓ARHL的进展[24],因此,控制ROS所造成的氧化应激可能是未来治疗老年性聋的主要方向之一。

4 线粒体DNA突变

线粒体负责重要的细胞功能,包括能量产生、细胞凋亡、细胞信号传导和钙储存,线粒体DNA(mtDNA)控制区的变异与不同疾病相关,包括癌症、亨廷顿病和β-地中海贫血[29],诸多研究表明mtDNA突变和ARHL的发生发展有关。

线粒体4 977 bp缺失在衰老组织中易被发现[30,31],包括在老年性聋患者的颞骨中,该缺失包含5个tRNA基因和7个多肽基因,其中2个编码ATP酶6和8[32],最近的研究也表明耳蜗线粒体4 977 bp缺失会阻碍线粒体氧化磷酸化,与ARHL的发生有着密切关联[33]。在ARHL小鼠模型中发现mtDNA的3 860 bp缺失显著增加[23,32],这与人体mtDNA的4 977 bp缺失产生的效果非常接近。除了基因片段大量缺失外,线粒体基因组中的点突变已被确定为老年性聋的重要因素。Falah等[29]发现,纳入试验的58例ARHL患者的mtDNA中16 223 C>T、16 311 T>C、16 249 T>C和15 954 A>C四个位点的突变频率与对照组相比显著提高。这些变异位于mtDNA控制元件mt5、mt3L、7S DNA、终止相关序列(termination-associated sequence,TAS)和线粒体单链DNA结合蛋白(mitochondrial single strand DNA binding,mtSSB)的结合位点附近,改变mtDNA中的功能性蛋白质结合位点,影响mtDNA的基因表达水平。

既往研究证实了过量ROS和氧化应激在老年性聋发展中的作用。随着年龄的增长,人体清除ROS的效率减低,导致氧化应激,同时造成mtDNA突变、呼吸链功能障碍、线粒体中ROS生成增加以及进一步突变,这一恶性循环导致细胞功能逐渐下降[32]。mtDNA变异可以改变线粒体电子传递链的功能,加强氧化应激,增加ROS的生成,从而诱导线粒体固有的凋亡途径[29]。

针对mtDNA的变异需要进一步研究,以探索预防、延缓或治疗相关疾病的新方法,同时,对于线粒体的研究或许可使其成为识别ARHL发病风险的重要生物标志物。

5 激素

多年来,人们发现男性中ARHL的发生率更高且病情更加严重[34],最近的研究发现,ARHL发病率、严重程度和发病年龄的性别差异仍然占主导地位[35],让人们联想到性别差异对听力的影响。在对大量育龄期女性、绝经后女性和雌激素替代治疗患者的观察中,发现雌激素水平越高,听力越好[36]。不同的研究结果相继表明,接受雌激素治疗的女性受试者ABR阈值水平较低、潜伏期较短,意味着更好的听力水平[36,37]。

关于雌激素如何保持听觉功能,一种常见的解释认为雌激素是一种重要的神经营养成分,它可以协助调节神经元存活,但会在衰老过程中丢失[37]。雌激素可能对耳蜗中的胰岛素样生长因子-1受体(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R)表达产生有益影响,因为雌激素处理的血管纹细胞在72 h内显示出IGF-1R水平的上升趋势。换言之,雌激素和IGF-1R可能在老化的耳蜗中具有共同依赖关系,在雌激素处理的血管纹细胞中观察到高的IGF-1R表达水平可以保护耳蜗感觉细胞免受变性。IGF-1R通过PI3K/AKT通路抑制促凋亡基因的DNA转录,耳蜗细胞将延缓凋亡,ARHL的症状也将延迟,然而目前仍需要更多的研究来确认IGF-1R激活哪些相关的细胞信号基因来刺激PI3K/AKT通路以减少细胞凋亡[37]。

雌激素受体(estrogen receptor,ER)亚型ERα和ERβ在内耳的血管纹、耳蜗血管和I型螺旋神经节细胞等区域有所分布。有学者认为雌激素受体对促进感觉细胞存活的复杂细胞信号通路起到门控作用,例如在雌激素的作用下,ERα在大脑中与磷酸肌醇3(PI3)激酶的p85亚单位相互作用,以激活PI3K/AKT神经保护信号通路[38]。

6 遗传因素

ARHL是一种多因素导致的复杂疾病,遗传因素起着至关重要的作用,35%～55%的老年性聋由遗传因素导致[39]。随着基因治疗在各种类型的动物实验和人体实验中取得成功,内耳遗传缺陷的深入研究显得十分重要[40]。

粘脂蛋白是一种瞬时受体电位(ransient receptor potential,TRP)阳离子通道,存在于溶酶体中,哺乳动物中的三种粘脂蛋白分别由Trpml1、2、3基因编码。研究表明缺乏粘脂蛋白1和3的小鼠ARHL进展加快,毛细胞中粘脂蛋白1和3同时缺乏会导致外毛细胞溶酶体增大、通透性增加,外毛细胞发生退化而导致ARHL的发生,Trpml1和Trpml3基因可能与ARHL的发生发展有关[41]。编码连接蛋白26(connexin26,Cx26)的基因突变是感音神经性听力损失的常见原因,Fetoni等[24]分析Gjb2+/-小鼠作为人类35delG杂合子携带者的模型,发现与对照组小鼠相比,Gjb2+/-小鼠的ABR和DPOAE随着时间的推移恶化得更快,表明GJB2基因对老年性聋的影响。谷胱甘肽S-转移酶(glurathione S-transferases,GSTs)和细胞色素P450(cytochromes P450,CYPs)等抗氧化酶参与细胞毒性化合物的代谢、解毒以及ROS的清除,这些酶的改变可能成为ARHL发展的风险因素。CYP1A1的rs4646903和rs1048943单核苷酸多态性以及GSTM1和GSTT1缺失被认为是ARHL的遗传风险因素,研究发现GSTM1+/GSTT1-基因型也增加了ARHL的易感性,rs1048943的单核苷酸多态性影响了CYP1A1的RNA结构[42]。在针对SLC26A4的CpG位点的甲基化检测中发现,ARHL患者一个CpG位点(CpG3)的甲基化水平显著升高;此外,与对照组相比,ARHL患者外周血中SLC26A4的转录水平显著降低,SLC26A4的CpG位点甲基化水平具有重要意义,从而为ARHL的诊断提供了一个潜在的标志物[43]。

最近的研究也陆续发现了DCLK1、SLC28A3、CEP104、PCDH20、SLC44A2、STRN和SIK3等基因与ARHL有一定的相关性[44],关于ARHL候选基因的研究还有待进一步深入,探索出特异性基因,以期对老年性聋的预测和诊断提供佐证。

7 小结

随着研究的深入,越来越多有关老年性聋发病机制的学说被提出,这些机制可以叠加作用,也可以相互影响。对既往研究总结发现,过量活性氧自由基的蓄积所导致的氧化应激会与线粒体DNA的突变形成恶性循环,二者共同导致线粒体的功能障碍,后者会进一步加重耳蜗突触病变的程度,线粒体异常可能是老年性聋的重要发病机制。基因突变影响着机体内离子的正常转运、氧化应激等多个环节,可能贯穿于老年性聋发生发展的各个过程,这也是人们努力探索干细胞和基因治疗的重要原因。

老年性聋的发病机制复杂,受遗传、环境、社会和医学等因素的影响。随着人口老龄化,其发病率将继续增加,但人们对于ARHL的重视程度仍然不够,因此应加强ARHL相关的健康教育和宣传,同时应致力于人类ARHL的早期检测、预防和管理。