施慧敏,张金洲,王 馨,朱 干,赵学峰,汪 会

由于病毒在肝脏中连续复制的特性,机体免疫系统会对病毒感染的肝细胞持续攻击,反复的肝损伤加重了机体的炎症和纤维化,进一步转变为肝硬化,继而引发肝功能衰竭[1]。 正电子发射计算机断层显像 (positron emission tomography/ computed tomography,PET/CT)除了对肿瘤之外,对炎症、感染和一些退行性病也适用,而氟代脱氧葡萄糖(18F-Fluorodeoxyglucose,18F-FDG)是PET检查中常用的放射性药物,可以定量测定肝脏中的葡萄糖代谢,可在炎症部位和感染部位累积[2]。全身动态18F-FDG PET/CT patlak显像中最大标准化摄取值(maximum standardized uptake value,SUVmax)是游离性六磷酸酶参与代谢,已被证明为有用的半定量测量方法,最大代谢率(the maximum metabolic rat of FDG, MRFDGmax)测得的是真实的六磷酸酶参与代谢,属于绝对化定量分析,避免了时间依赖性,具有传统显像无法获得的FDG代谢的动力学信息[3]。该实验拟构建大鼠肝炎、肝纤维化、肝硬化模型,通过全身动态18F-FDG PET/CT Patlak显像,探讨定量参数MRFDGmax、SUVmax在大鼠肝炎、肝纤维化及肝硬化阶段的应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器98%四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)溶液购自合肥宝添科贸有限公司;橄榄油及乙醇溶液购自上海麦克林生化科技有限公司;α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)免疫组化试剂购自武汉赛维尔生物技术有限公司。显像采用德国Siemens Biograph Vision PET/CT仪;18F-FDG购自南京江原迪科正电子研究发展有限公司。

1.2 实验动物雄性SD大鼠24只,6～7周龄,体质量170～210 g,购自辽宁长生生物技术股份有限公司[许可证号(SCXK(辽)2020-0001]。所有大鼠都被饲养于温度为26±1 ℃,相对湿度为(50±1)%,光/暗周期为12/12 h的SPF级动物房中,所有实验动物方案均获安徽医科大学实验动物伦理委员会批准,批号：LLSC20221252。

1.3 实验动物分组及处理本研究选取造模成功的大鼠分为肝炎、肝纤维化、肝硬化、正常组,每组6只,进行实验研究分析。正常组给予正常饮食,各模型组均采用左右腹部皮下交替注射50% CCl4油溶液加乙醇复合法进行诱导,每4 d注射1次,乙醇溶液为唯一饮用水,详见图1 。

图1 各组SD大鼠模型诱导流程图

1.4 全身动态18F-FDG PET/CT显像分别对4组大鼠进行显像,显像前禁食8 h,可自由饮水,采集图像前将大鼠用异氟烷麻醉并仰卧位固定于PET/CT扫描床上,先进行5 s低剂量的全身CT采集(管电压120 KV,管电流160 mA,螺距5.0 mm),然后将检查床移动于PET检查视野内,在大鼠尾静脉注射37 MBq的18F-FDG,注射同时开始以心脏为中心进行6 min动态单床PET扫描,随后进行18次连续全身PET扫描,动态扫描时间75 min。扫描结束后,对原始数据进行重建(参数：迭代4,子集5,矩阵为128×128),重建结束后,以左心室为感兴趣体积进行勾画,生成左心室时间-活度曲线(tumor time activity curve, TAC),并作为输入函数利用Patlak图像分析获得MRFDGmax,从而生成MRFDG参数图像,取最后一帧动态扫描所获得的图像为SUVmax图像。在扫描过程中时刻关注大鼠生存状态。

1.5 图像分析由2位资深核医学科医师对图像进行分析,选取肝组织受损最大层面勾画感兴趣区域(region of interest,ROI),测量肝脏的MRFDGmax、SUVmax和CT值并对体质量的MRFDGmax和SUVmax进行校正。

1.6 生化指标与组织病理检测PET/CT显像完成后采取颈椎脱臼法处死大鼠,对大鼠进行腹主动脉取血,采血结束后迅速取出肝脏。全血标本于室温放置2 h后于2～8 ℃,3 000 r/min,离心15 min,取上清液利用自动生化分析仪检测大鼠各阶段血清中的谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的水平。取出肝脏并用体积分数4%的多聚甲醛溶液固定,石蜡包埋4 μm切片,正常组、肝炎组及肝硬化组行HE染色,肝纤维化组行Masson染色。免疫组化检测α-SMA表达情况,在高倍镜视野下每张切片随机取5个视野拍照,使用Image-Pro Plus 6.0软件进行定量分析。

2 结果

2.1 实验动物造模存活情况整个实验造模共选取48只大鼠,分别为正常组8只,肝炎组10只,肝纤维化组12只,肝硬化组18只。见图2。造模结束后,正常组大鼠无死亡,肝炎组大鼠死亡1只,肝纤维化组大鼠死亡1只,肝硬化组大鼠死亡3只,造膜成功后每组随机选取6只进行全身动态18F-FDG PET/CT扫描。

图2 Kaplan-Meier 法分析各组SD大鼠生存率

2.2 全身动态18F-FDG PET/CT显像结果全身动态PET/CT显像示,各组SD大鼠肝脏模型均有不同程度的弥漫性放射性摄取,详见图3。各组的MRFDGmax值与SUVmax差异均有统计学意义(F=38.35,P<0.001;F=84.54,P<0.001)。肝纤维化组和肝硬化组的CT值差异无统计学意义(t=-0.407,P=0.693)。正常组、肝炎组分别与肝纤维化组及肝硬化组进行统计学分析,差异有统计学意义(F=112.25,P<0.001),CT图结果显示低分辨率CT不能鉴别肝纤维化组及肝硬化组大鼠肝脏密度差异,详见图4。

图3 各组SD大鼠全身动态18F-FDG PET/CT Patlak显像图

图4 各组大鼠MRFDGmax(A)、SUVmax(B)及CT值 (C)统计分析图

2.3 生化检测结果与正常组相比,肝炎组、肝纤维化组及肝硬化组AST、ALT及ALP呈阶段性上升,差异均有统计学意义(F=93.32、64.63、145.03,P<0.001或=0.002),详见表1 。

表1 各组大鼠血清检测指标变化

2.4 病理学检测结果镜下观察,正常组HE染色显示肝细胞排列整齐,小叶结构显示完整,未见肝细胞变性、淤血、增生;肝炎组HE染色可见大量的肝细胞脂肪变性,胞质内见大小不一的圆形空泡及炎性细胞小灶性的浸润,即造模成功;肝纤维化组Masson染色示肝脏组织局部可见被膜增生变厚,多见窦周或汇管区的胶原纤维增生形成短纤维间隔,即造模成功;肝硬化组HE染色显示组织中广泛可见大量血管周围有结缔组织增生,形成大量桥接及假小叶,伴有淋巴细胞浸润,多见核分裂像,即造模成功。肝炎组、肝纤维化组及肝硬化组α-SMA阳性细胞表达增加,呈阶段性上升,差异有统计学意义(F=80.57,P<0.001),详见图5、6。

图5 各组SD大鼠肝脏组织病理及免疫组织化结果 ×400

图6 各组SD大鼠肝脏α-SMA阳性细胞表达

2.5 指标相关性分析4组肝脏组织SUVmax与MRFDGmax呈明显正相关(r=0.967,P<0.01),肝炎组、肝纤维化组及肝硬化组中α-SMA阳性细胞表达整体与AST、ALT、ALP均呈正相关(r=0.924、0.756、0.934,P<0.01),详见图7。

图7 SUVmax与MRFDGmax(A),α-SMA与AST(B)、ALT(C)、ALP(D)相关性分析

3 讨论

肝炎、肝纤维化和肝硬化均导致肝脏功能损害,而肝硬化是全球相关肝脏死亡的主要影响因素[4]。临床上主要依靠于检验、肝活检穿刺、CT及多普勒超声等了解病变的程度,以上方法均有明显的不足之处,如肝活检穿刺为有创性检查,CT值对于肝纤维化与肝硬化区分不明显,多普勒超声易受操作者影响,可重复性差。而全身动态18F-FDG PET/CT可以广泛监测组织代谢及炎症部位的累积,以分子水平的方式对病灶进行诊断分析。本实验通过全身动态18F-FDG PET/CT Patlak显像,由实验结果得出定量参数MRFDGmax和SUVmax值对监测肝炎、肝纤维化和肝硬化阶段具有一定的应用价值。

动脉采血作为输入函数的“金标准”,为有创性操作且完成难度大,以心脏为ROI作为输入函数可减小操作难度并为无创性[5]。在此基础上,全身动态PET/CT通过动态监测获取左心室TAC作为输入函数,用于Patlak分析肝组织中的MRFDGmax,其仅反映组织中参与代谢的葡萄糖水平,抑制了血池中葡萄糖信号、背景组织摄取及游离葡萄糖对病灶分析的影响,已经被用于更具体地评估示踪剂的摄取,能实现对病灶的定量分析[6]。SUVmax反映靶组织中总葡萄糖的摄取,是最常见的半定量分析指标,SUVmax与MRFDGmax之间具有显著相关性,参数MRFDGmax与SUVmax互补能够对病灶进行更准确的分析[7-8]。近年来,在肝炎发展为肝纤维化进一步转变为肝硬化的情况下,18F-FDG被用于测定肝组织中葡萄糖代谢,炎症细胞中不可逆的FDG积累导致肝脏FDG摄取的增加,随着肝脏代谢和功能下降的加重,活跃的炎症细胞减少,是肝硬化肝脏中FDG摄取减少的潜在原因[9]。在本实验中通过全身动态PET/CT Patlak分析MRFDGmax与SUVmax的变化来反映肝脏组织对18F-FDG的摄取程度,从而反映肝组织的受损阶段;肝炎组和肝纤维化组的肝组织MRFDGmax、SUVmax均较正常组增高,增加了对18F-FDG的摄取,反映出受损肝组织的炎症细胞活跃程度,而肝硬化组MRFDGmax、SUVmax较正常组降低,炎症细胞减少,对18F-FDG摄取减少;综上表明在SUVmax半定量分析的基础上引入MRFDGmax值用于确定代谢率,对影响SUVmax测量的变化表现出更大的稳健性。

组织血清中一些重要的生化指标水平可作为肝损伤的重要诊断因素,有研究[10]表明AST、ALT及ALP是肝细胞的细胞质酶,高AST、ALT、ALP与炎症及纤维化程度具有较高相关性。α-SMA是肝星状细胞被激活状态下所表达的,肝细胞中α-SMA阳性表达的增加,参与胶原生成的蛋白质增多,加剧了肝星状细胞纤维化的进程,因此α-SMA被认为是肝纤维化进程中的重要标志[11-12]。生化结果显示随着肝损伤程度的增加,AST、ALT、ALP的水平较正常组不断增高,且免疫组化结果显示α-SMA在肝炎组、肝纤维化组及肝硬化组中表达不断增加,α-SMA分别与AST、ALT、ALP呈正相关,进一步验证了全身动态18F-FDG PET /CT Patlak显像结果与组织病理学检查结果一致,且在实验动物存活的情况下,用非侵入性的方法观察肝炎、肝纤维化和肝硬化阶段肝脏代谢参数的改变,对临床早发现早预防具有重要意义。