齐琳琳 温春秀 刘灵娣 姜涛

摘要 以荆芥种子萌发的幼苗为材料，开展秋水仙素诱导染色体倍性变异的最佳浓度和最適处理时间研究，调查比较多倍体植株的农艺性状。结果表明：用0.10%秋水仙素溶液处理荆芥幼苗生长点3 d最有利于四倍体的产生，诱导率达到1.15%。显微镜观察变异植株根尖染色体数目为2n=4x=24。田间表现四倍体植株较二倍体植株叶片厚大、叶色浓绿、穗多且密、种子大，且四倍体植株较二倍体植株有效成分含量提高。

关键词 荆芥；秋水仙素；多倍体；农艺性状

中图分类号 S567  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2024）03-0175-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.03.042

Polyploid Induction and Agronomic Evaluation of Schizonepeta tenuifolia

Abstract Using germinating seedlings of Schizonepeta tenuifolia as materials，the optimum concentration and treatment time of colchicine induced chromosomal ploidy variation were carried out，the agronomic characters of polyploid plants were investigated and compared. The results showed that 0.10% colchicine solution was the most beneficial to tetraploid production at the growth point 3 d of Schizonepeta tenuifolia seedlings， and the induction rate reached 1.15%. The number of chromosome in the root tip of the mutant plants was 2n=4x=24. Compared with diploid plants， tetraploid plants had thicker leaves， darker green leaves， more dense ears and larger seeds， and the content of effective components in tetraploid plants was higher than that in diploid plants.

Key words Schizonepeta tenuifolia;Colchicine;Polyploidy;Agronomic character

荆芥（Schizonepeta tenuifolia Briq.）为唇形科植物荆芥的干燥地上部分［1］，又称为香荆芥、线芥、四棱杆蒿、假苏［2］，以全草或花穗入药，分别为荆芥和荆芥穗。荆芥味辛、苦，性微温，归肺、肝经［3］，具有祛风解表、宣毒透疹、散瘀止血之功效［4］，常用于感冒发热、头痛、咽喉肿痛、麻疹、风疹等［5］，为中医临床常用药物［6］。现在入药用的荆芥大部分为人工培育而成［7］，在全国大部分地区均有种植，主要分布在河北、江苏、浙江、江西、湖北、湖南和东北三省等地，其中河北安国和浙江萧山最为有名［8］。

荆芥由于其重要的药用价值和广泛的药理作用越来越引起人们的关注。多年来，国内外学者对荆芥进行了广泛的研究，尤其是化学成分和药理作用方面进行了深入探讨，但是针对其多倍体诱导方面的研究却很少。目前国内针对荆芥种质资源倍性的系统研究鲜见报道。该研究采用秋水仙素处理植株生长点诱导获得变异植株，通过流式细胞术和根尖染色体鉴定多倍体的方法，获得了四倍体荆芥，为今后的新品种选育奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 供试材料荆芥种子来源于河北安国。

1.2 诱导方法

播种荆芥种子，待荆芥幼苗长出两对真叶时，用带针头的注射器分别吸取浓度0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%的秋水仙素溶液，滴1滴溶液在待处理的亲本幼苗生长点上，以后每天09：00和16：00处理一次，分别处理3、4、5 d，设对照，共18个处理。

1.3 多倍体的鉴定方法

1.3.1 形态学鉴定。

将处理后长出新芽的荆芥与对照植株进行比较，筛选出具有叶片变厚、叶色变绿、叶片皱缩、植株生长缓慢等特点的变异植株，进一步进行倍性鉴定。

1.3.2 流式细胞术倍性鉴定。

采用Cytoflex流式细胞仪（美国Beckman公司）进行染色体倍性鉴定。取荆芥待鉴定植株第二对真叶以上的幼嫩叶片1 cm2，加提取缓冲液1.5 mL后用锋利的刀片将叶片迅速垂直切碎，然后用300目滤网过滤到1.5 mL离心管中，得到细胞悬浮液。1 000 r/min离心3 min，倒出上清液，在管中加入50 μL提取缓冲液和50 μL DAPI染液（染液中加入适量RNA酶，排除双链RNA的干扰，浓度为50 μg/mL）混匀，避光染色1 min后上机检测。荧光通道选择PB450-A。

1.3.3 根尖染色体鉴定。

待疑似多倍体植株生长成熟收获种子后，取其种子培养生根，采用压片法进行根尖染色体的检测。选择在荆芥种子幼根根尖分裂最活跃的时期（08：00—11：00）取其根尖1 cm左右，置于冰水混合物中于4 ℃冰箱中预处理24 h，卡诺固定液（无水乙醇∶冰醋酸=3∶1）处理24 h，流动水洗2～3次，在1 mol/L的稀盐酸中解离2 min（解离期间置于冰水混合物中），60 ℃恒温水浴4 min左右，流动水洗2～3次，吸干根表面的水分后切取1～3 mm的分生组织，用改良的卡宝品红染色液染色20 min左右后压片，使用Nikon E100光学显微镜镜检、拍照，观察染色体数目。

1.4 多倍体株系的建立和田间农艺性状鉴定

在显微镜下观察根尖染色体，重复3次以上均为多倍体，确定获得的植株为多倍体，育苗后移栽至试验田，进行田间农艺性状观察与记录。经2年田间农艺性状鉴定和调查，选育出多倍体性状特征明显、农艺性状较好的荆芥株系进一步扩大繁殖，以便进行品种比较试验和示范推广应用。

1.5 荆芥中主要有效成分含量测定 用高效液相色谱法［1］测定荆芥二倍体与四倍体株系中胡薄荷酮含量，用于评价多倍体株系的药材质量。

2 结果与分析

2.1 不同浓度秋水仙素对荆芥多倍体的诱导效果

分别用0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%浓度的秋水仙素溶液处理荆芥幼苗生长点3、4、5 d，待荆芥长出新芽后，用流式细胞仪进行染色体倍性的初步鉴定，得到疑似多倍体植株；移栽大田单株收种后，用根尖进行染色体鉴定，经3次以上鉴定确定四倍体。试验结果（表1）表明：0.10%秋水仙素溶液处理荆芥幼苗生长点3 d时，诱导率最高，为1.15%。

2.2 荆芥四倍体的流式细胞术筛选

流式细胞术鉴定法因其制样简单、灵敏度高、分辨率高、准确性好、数据的可重复性好、测试速度快、植物损伤性小，目前已经成为倍性鉴定的主要方法，尤其适合大量样品的染色体倍性分析［6］。将诱导后长出新芽的荆芥与对照植株进行比较，筛选出具有叶片增厚、叶色变绿、植株生长缓慢等特点的目标植株，经流式细胞仪检测结果（图1）显示，对照的峰值处于35×104道附近，四倍体的峰值处于70×104道左右，约为对照的2倍，峰值出现与染色体倍性关系准确。

2.3 荆芥四倍体根尖染色体鉴定

根尖染色体鉴定结果（图2）表明，荆芥二倍体植株根尖染色体数目为2n=2x=12，四倍体植株根尖染色体数目为2n=4x=24，增加了1倍。

2.4 四倍体荊芥农艺性状评价

二倍体和四倍体荆芥植株在株高、叶片大小及形状、花大小等性状上有明显差别（表2）。四倍体幼苗的叶片较二倍体大而厚，叶色浓绿（图3）。田间性状调查结果表明，四倍体植株较二倍体植株株型矮，分枝数少，茎秆粗，顶端裂片短而宽，花大，叶片皱缩，穗多、穗密（图4），种子较大（图5）。

2.5 四倍体株系与二倍体株系药用成分含量比较

经过多年田间性状筛选及药用成分含量检测，得到6个优良株系，分别为J-448、J-203、J-563、J-564、J-625、J-596。依据《中国药典》标准对其药用成分胡薄荷酮含量进行检测，结果发现（图6），四倍体株系的胡薄荷酮含量比对照品种的胡薄荷酮含量高，最高达0.231%，高于药典含量（0.020%）。

3 讨论与结论

自然界多倍体虽然分布广泛，但数量有限［9］，因此，需要人工诱导。秋水仙素是目前多倍体育种中应用最广泛的化学试剂之一［10］，该研究采用不同浓度的秋水仙素处理荆芥幼苗生长点，确定最适秋水仙素处理浓度为0.10%，最适处理时间为3 d，此时的多倍体诱导率最高，可达1.15%。研究结果显示，与二倍体相比，荆芥多倍体植株的叶片厚大且叶色浓绿，果穗多且密，种子明显变大。通过对其药用成分检测，胡薄荷酮含量明显高于《中国药典》标准。

该研究获得的荆芥多倍体植株，将进行多年田间筛选鉴定，对稳定株系开展生物学特性、农艺性状、营养成分及药用成分比较分析，以产量和药用成分含量作为核心选育指标，选育获得多倍体新品系。

参考文献

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2020年版 一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2020：243.

［2］ 黄晓巍，刘玥欣，刘轶蔷，等.荆芥化学成分及药理作用研究进展［J］.吉林中医药，2017，37（8）：817-819.

［3］ 泽仁拉姆，普珍，卓玛东智，等.荆芥的化学成分和药理作用［J］.现代医药卫生，2014，30（2）：215-217.

［4］ 钱雯，单鸣秋，丁安伟.荆芥的研究进展［J］.中国药业，2010，19（22）：17-20.

［5］ 马艳芝.不同荆芥种质资源的AFLP标记和ITS序列分析［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2017，45（6）：228-234.

［6］ 刘红彬，顾小龙，张海红，等.基于ITS序列的不同产地裂叶荆芥系统发育分析［J］.植物遗传资源学报，2012，13（6）：1073-1077.

［7］ 刘英男，牛凤菊，辛义周，等.荆芥的化学成分、药理作用及临床应用研究进展［J］.中国药房，2020，31（11）：1397-1402.

［8］ 赵立子，魏建和.中药荆芥最新研究进展［J］.中国农学通报，2013，29（4）：39-43.

［9］ 韦荣昌，吴庆华，马小军，等.植物多倍体的研究进展［J］.种子，2013，32（7）：50-52.

［10］ 蔡文燕，吴水金，潘一山.金线莲多倍体诱导的初步研究［J］.西南师范大学学报（自然科学版），2010，35（1）：90-93.