余利 孟祥涛 陈甦 潘怀松 段海明

摘要 检测了6株拮抗菌发酵上清液对栝楼根腐病菌的抑制活性，采用菌丝生长速率法测定优势拮抗菌不同接种量和发酵时间对发酵上清液抑菌活性的影响，测定了不同稀释倍数的发酵上清液和脂肽粗提物对栝楼根腐病菌的抑制活性。结果表明，对栝楼根腐病菌抑制活性最高的拮抗菌为SJ1623，种子液培养时间为10 h，0.75%（体积比）的接种量效果较好；发酵上清液稀释10倍对病菌的抑制率为87.6%，脂肽粗提物50倍稀释液对病菌的抑制率为83.1%。

关键词 栝楼根腐病；拮抗菌；发酵液；抑制活性

中图分类号 S435.67  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2024）03-0119-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.03.028

Inhibitory Activity of Fermentation Metabolites of Antagonistic Bacteria SJ1623 Against Trichosanthes kirilowii Fusarium Root Rot

Abstract The inhibitory activity of the fermentation supernatant of 6 antagonistic bacteria against Trichosanthes kirilowii Fusarium root rot was detected.The effects of different inoculation amount and fermentation time of the dominant antagonistic bacteria on the antifungal activity of fermentation supernatant were determined by the mycelial growth rate method.The inhibitory activity of fermentation supernatant and crude lipopeptide extract against Fusarium sp.was determined.The results showed that the antagonistic bacteria SJ1623 had the highest inhibitory activity.The seed liquid culture time was 10 h，and the inoculation amount of 0.75% （ volume ratio ） was better.The inhibition rate of the fermentation supernatant diluted 10 times was 87.6%.The inhibition rate of 50 times dilution of crude lipopeptide extract was 83.1%.

Key words Trichosanthes kirilowii root rot；Antagonistic bacteria；Fermentation broth；Inhibitory activity

栝樓（Trichosanthes kirilowii）是葫芦科栝楼属多年生缠绕性藤本植物。栝楼的种子、根、茎、叶、瓜皮皆可做优良的中药材，具有解热止渴、利尿、镇咳祛痰、扩张冠状动脉、抗肿瘤、抑制血小板凝集等药理功能［1-2］。栝楼属于多年生宿根植物，一旦地下发生根腐病对其生长造成严重的影响，轻则因营养不良而造成减产，重则引起整株死亡而导致绝收［3］。

栝楼根腐病的致病因素比较复杂，主要分为生物因素和非生物因素2个方面，其中生物因素主要由病原真菌、线虫和细菌引起，而非生物因素则由水分胁迫、土壤及其营养元素失衡等造成，二者致病因素混合存在导致根腐病发生更为严重。闫龙民等［4］研究表明，栝楼块根中锌和磷的含量越高，根腐病的发病率越低，可通过加施上述2种元素的方法减轻损失。栝楼根腐病大多数是由镰孢属真菌（Fusarium sp.）侵染引起，具有明显的积年流行病害的特征，应提早开展防治工作［5］。施用多菌灵、福美双、苯醚甲环唑等化学药剂不能彻底根除该病害的发生，而且连年施用对环境具有较大破坏作用，不利于中药材的药品安全［6］。目前，对栝楼等中药材根部病害主要采取生物防治的相关措施，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）等微生物菌剂以及功能菌发酵制备的生物有机肥已较为广泛地应用于中药材根腐病的防治，在部分地区产生了可观的效果，但应用益生菌防治病害受到菌株种类、环境、施用方法等的影响较大，总体推广应用面积较小［7］。因此，通过系统研究筛选更加高效广适的拮抗菌对于栝楼根腐病的防治具有重要意义。笔者以栝楼根腐病菌（Fusarium sp.）为靶标菌，开展拮抗菌株筛选研究，进而为栝楼根腐病的可持续防控提供优良的生防菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株。

栝楼根腐病菌（Fusarium sp.）、细菌菌株SJ1510、SJ1519、SJ1623、GFJ-3、D-1和F-1由安徽科技学院植物土传病害生物防治研究室分离纯化并保存。

1.1.2 供试培养基。

PDA培养基、NA培养基和NB培养基参照方中达［8］的方法配制。

1.2 方法

1.2.1 6株拮抗菌对栝楼根腐病菌的抑制活性及优势菌的生长曲线。

无菌条件下将6株细菌划线培养至NA培养基平板上，置于26 ℃恒温箱中培养72 h，待菌苔长出后接种到装有15 mL NB培养基的试管中，以140 r/min摇培10 h，然后用分光光度计以无菌NB培养基为对照调整OD600=1.0，然后再以0.2%（体积比）的接种量接种到装有50 mL NB培养基的150 mL三角瓶中，140 r/min摇培72 h，得到菌株的发酵液置于4 ℃、10 000 r/min的离心机中离心10 min得到上清液。吸取5 mL发酵上清液和2.5 mL 1 000 mg/L硫酸链霉素水溶液同时加入42.5 mL冷却到 40～60 ℃的PDA培养基中，迅速充分混匀后倒3个平板，对照加入等量和上述浓度相同的硫酸链霉素溶液和5 mL灭菌水，重复3次。待平板凝固，接种培养144 h菌落边缘的菌饼（直径为7 mm），然后置于26 ℃恒温培养箱中连续培养144 h后测量菌落直径，求出不同菌株发酵上清液对病菌的抑制率，优选出抑制效果较好的拮抗菌株用于以下试验。

1.2.2 不同接种量对病菌的抑制活性影响测定。

按照“1.2.1”制备的种子液按照0.062 5%、0.125 0%、0.250 0%、0.750 0%、1.000 0%、1.500 0%（体积比）的接种量接种到装有50 mL NB培养基的150 mL三角瓶中摇培，同样按照“1.2.1”的方法制备发酵上清液，检测不同接种量制备的发酵上清液对病菌抑制活性的影响。

1.2.3 不同发酵时间对病菌的抑制活性影响测定。

按“1.2.1”和“1.2.2”优化试验条件开展不同培养时间对病菌抑制活性的影响。接种完毕后，发酵摇培时间分别为24、48、60、72、84、96和120 h，检测不同发酵培养时间制备的发酵上清液对病菌抑制活性的影响。

1.2.4 不同稀释倍数的发酵上清液对栝楼根腐病菌的抑制活性测定。

参照“1.2.1”的方法检测最优条件下制备的发酵上清液原液和原液的1.5、3.0、4.0和8.0倍稀释液的抑菌活性，然后求出不同浓度的发酵上清液对病菌的抑制率。

1.2.5 不同脂肽粗提物对栝楼根腐病菌的抑制活性测定。

采用邓建良等［9］方法略有改进制备脂肽粗提物。将脂肽粗提物分别稀释5、7、10、15、20和40倍，脂肽粗提物的抑菌活性检测方法同“1.2.4”发酵上清液的检测方法。

1.3 抑制率计算公式以及数据分析

抑菌率=（对照菌饼直径-处理菌饼直径）/（对照菌饼直径-菌饼直径）×100%；所得数据采用Excel 2007和IBM SPSS statistics 25.0 进行分析。

2 结果与分析

2.1 6株拮抗菌发酵上清液对栝楼根腐病菌的抑制效果

从表1可以看出，6株拮抗细菌对栝楼根腐病菌的抑制率从高到低的顺序为SJ1623、SJ1519、D-1、GFJ-3、F-1和GFJ1510。其中SJ1623的抑制效果最好，抑制率达82.1%，GFJ1510的抑制效果最差为44.6%。筛选出菌株SJ1623作为下一步的研究对象。

2.2 拮抗菌SJ1623的生长曲线

由图1可知，0～6 h为菌株生长的延滞期，6～14 h为对数生长期，然后进入稳定期。因此，选定菌株对数生长的中期10 h作为种子液的培养时间。

2.3 拮抗菌SJ1623不同接种量的发酵上清液对病菌的抑制活性

由图2可知，随着接种量的不断增加，拮抗菌产发酵上清液的抑制率呈逐渐上升后下降的趋势。接种量为0.750 0%（体积比）抑制率达最高为85.74%，接种量为0.062 5%抑制率最小为62.85%。由此可知，初始接种量对发酵上清液抑制活性的影响较大，当接种量较小时菌体增殖较慢，产生的抑菌物质较少；然而接种量过大对抑菌物质的产生同样不利，推测接种量过大导致发酵培养基中的基质营养物消耗过快，导致营养物缺乏或溶氧不足，从而使抑菌效果下降。

2.4 拮抗菌SJ1623不同发酵培养时间的发酵上清液对病菌的抑制活性

由图3可知，随着培养时间的延长，拮抗菌產发酵上清液的抑制率逐渐上升后缓慢下降。培养时长为84 h时抑制率最高为87.13%，培养时长为24 h抑制率最小为39.58%。说明培养时间过短，菌量少抑菌活性物质产生少，但随着培养时间增加，菌量进一步增大，可能由于大量菌体的存在致使抑菌活性物质被菌体吸附而抑菌效果下降，也有可能是抑菌物质被进一步分解转化为其他抑菌活性下降的物质。

2.5 拮抗菌SJ1623发酵上清液对栝楼根腐病菌的抑制活性

由表2可知，SJ1623发酵上清液的浓度从12.5 mL/L增至100.0 mL/L时，发酵上清液对栝楼根腐病菌的抑菌率从40.2%增至87.6%，说明发酵上清液对栝楼根腐病菌具有较高的活性，稀释倍数小于15倍所达到的抑菌效果较好。

2.6 拮抗菌SJ1623脂肽粗提物对栝楼根腐病菌的抑制活性

由表3可知，从发酵上清液中提取的脂肽粗提物对栝楼根腐病菌的抑制效果明显高于发酵上清液对病菌的抑制效果， 50倍稀释液的抑菌率可达83.1%。然后随着稀释倍数的增加抑菌率开始降低，因而对病菌要有较高的抑制效果，其稀释倍数应小于70倍。

3 结论与讨论

近年来，栝楼种植效益较高，种植面积扩大较快，但由于栝楼为多年生宿根植物，为根部病害的发生创造了良好条件［10］。栝楼根腐病的发生受到多重因素的影响，应全方位考虑。如不合理灌溉施肥导致土壤酸化，土壤微生物群落结构失调导致土壤微生物多样性降低、种群结构简单，有益微生物的生长受到抑制，有益菌逐渐受到有害菌的排斥，从而使土壤从细菌主导型向真菌主导型转化，最终导致以根腐病为代表的土传病害愈演愈烈［11］。

生物防治措施作为延缓土传病害发生的治本措施，已形成诸多重要成果，也为营造绿色可持续的农业生产环境提供了重要实践路径［12］。栝楼根腐病的生物防治措施报道较少，但其主要致病菌——镰孢菌（Fusarium sp.）为代表的葫芦科植物根腐病相关生物防治研究较多。曹云娥等［13］采用平板对峙法结合抑制菌丝生长速率法，从蚯蚓堆肥中筛选到 1 株对 4 种瓜类枯萎病菌均有显著抑制效果的拮抗细菌 WQ-6，经鉴定为暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis），其对瓜类枯萎病菌具有广谱性防效，发酵液10倍稀释液的抑菌率为34.96%～46.75%；张涵等［14］从河南南阳桐柏山景区土壤中分离筛选到一株对苦瓜枯萎病菌具有抑制效果的短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis TB17），发酵液10倍无菌滤液对病菌的抑制率为54.95%，盆栽防效达76.92%。该研究所得的菌株SJ1623的发酵上清液10倍稀释液的室内菌丝生长抑制率达80%以上，说明其应用价值更大，活体试验需要进一步探究。脂肽类物质为拮抗细菌发酵液中提取的重要抑菌活性物质［15］。向亚萍等［16］报道芽孢杆菌产脂肽类抗生素是抑制植物病原真菌的主要成分，其中伊枯草菌素（iturins）的结构变化及其分泌量与抑菌活性具有相关性。该研究所提取的脂肽类物质对栝楼根腐病菌的抑制活性明显高于发酵上清液，同样也说明脂肽类物质在抑菌方面发挥重要作用，下一步应研究脂肽类物质中起主要抑菌作用的活性成分，从而为菌株的开发利用提供基础数据。

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