湛佳伟,朱紫童,李晨依,温海洋,贺 帆,贾宏昉

(河南农业大学 烟草学院,郑州 450002)

磷是植物生长发育的三大营养元素之一,是细胞中很多重要的生命物质的参与者,如磷脂、蛋白质、核苷酸等都离不开磷[1]。相关研究表明磷缺乏影响烟叶的正常发育,从而影响烟叶的产量和品质[2]。因此,如何提高作物的耐磷能力是现代农业分子育种的一个重要研究方向。虽然土壤中含有丰富的磷,但大部分的磷是有机态形式存在,只有少部分可溶性无机磷酸盐能够被作物吸收利用[3]。因此,在实际生产中需要外加磷肥以满足作物的生长发育。有研究表明植物从土壤中吸收的磷主要是依靠磷酸盐转运蛋白完成[4]。已知的植物磷转运蛋白基因可划分为5个家族:PHT1家族、PHT2家族、PHT3家族、PHT4家族、PHT5 家族,分别定位于细胞质膜、叶绿体内膜、线粒体膜、高尔基体膜和液泡膜上[5-8]。这些不同家族的基因成员在植物生长发育过程对磷酸盐的吸收、转运和再分配等发挥重要作用[9]。目前,关于PHT1 家族成员的报道比较多,该基因家族所编码的蛋白大部分属于高亲和磷酸盐转运蛋白,主要负责植株根系从土壤中摄取磷酸盐[10]。相比之下,虽然PHT2 家族基因在很多植物中也有不少报道,但研究深度远远不够。到目前为止,PHT2家族只挖掘了PH T2;1这1 个基因成员。PHT2;1基因编码低亲和磷酸盐转运蛋白,该基因在很多植物中被克隆,包括拟南芥At PHT2;1[11]、辣 椒Ca PHT2;1[12]、苜 蓿Mt PH T2;1[13]、小 麦Ta PH T2;1[14]、水 稻Os-PHT2;1[15]、茄子Sm PHT2;1[16]等,并且在这些植物中的研究均表明PHT2;1蛋白定位于叶绿体内膜上[11-16]。Ahmad等[12]对辣椒Ca PHT2;1的表达特性分析发现,Ca PH T2;1主要在叶片中高表达,在根部几乎不表达,并且在低磷胁迫下,Ca PH T2;1在叶片和根中的表达量都很低[12]。史书林[15]在水稻中研究发现,在正常供磷条件下,Os-PH T2;1过表达使水稻地上部分的磷含量显著提高,间接提高了水稻根系对磷的捕获能力,并且该基因在叶片中强烈表达,在根系中几乎不表达,低磷胁迫和光照时长的增加都能使该基因的表达量显著升高[15]。Zhao等[17]发现苜蓿的MtPHT2;1 蛋白定位叶绿体,能够调控磷酸盐进入叶绿体,该基因转录水平受到光照和磷酸盐浓度的影响,并且在新叶中的表达量高于其他组织。

烟草(Nicotiana tabacumL.)是中国最重要的经济作物之一。在烟叶生产中,磷素养分供应不足,不仅会限制烟株的长势,而且使烟叶的产量和品质受到影响。巴西优质烟叶磷含量为0.20%～0.28%,而中国烟叶磷含量达到巴西优质烟叶磷含量的理论概率为59.8%[18]。因此,探究PHT 基因家族在调控烟草对磷酸盐吸收和转运方面的机制,为通过生物技术改善烟草对磷酸盐的吸收和利用能力提供理论依据,从而达到改善烟叶品质的目的。目前对烟草中磷转运蛋白基因的研究较少,王艳丽等[19]探究了烟草PHT1家族的2个基因在磷胁迫下的表达模式,发现PH T1基因主要在叶片中高表达,PHT2基因在根部高表达,并且这2 个基因受磷胁迫诱导表达量升高。虽然已经证实PH T2;1基因参与植物体内磷酸盐的转运和再利用以及光合作用等过程,但烟草中Nt PH T2;1的功能还未见报道。因此,该研究以烟草为材料,从普通烟草K326中克隆1个磷转运蛋白家族成员Nt PHT2;1,通过生物信息学分析、qRT-PCR、亚细胞定位等技术探究烟草Nt PH T2;1在磷的吸收和再利用过程中功能是否保守,以期为通过Nt PHT2;1培育烟草磷元素高效利用新品种提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料及培养条件

普通烤烟品种K326为供试材料,烟草种子用霍格兰营养液水培法,待种子露白后,将其放置于人工气候温室中进行培养,培养条件是光照16 h/28℃,黑暗8 h/25℃,光强为300μmol/(m2·s),相对湿度为60%。烟苗幼苗用霍格兰营养液培养21 d后,开始对幼苗进行低磷(0.05 mmol/L)处理(LP)、高 盐(150 mmol/L NaCl)、干 旱(10% 的PEG-6000)、低温(4℃)等非生物胁迫处理[20],并设置1个正常处理(1 mmol/L Pi)作为对照(CK)。除低温处理3 h外,其他处理均为7 d。处理结束后,取各处理长势一致的3株烟苗,用离子水洗涤后,提取样品的根、茎、新叶和老叶(新叶为烟苗从上往下数的第3 叶位,老叶为烟苗从上往下数的第7 叶位),用来检测不同处理下烟草Nt PH T2;1的表达情况。

1.2 方 法

1.2.1 目的基因克隆

从NCBI网站上查找Nt PH T2;1基因的参考序列(GenBank 序列号:XP_016442645.1),使用Primer Premier 6软件设计烟草Nt PH T2;1基因CDS序列的特异性扩增引物(表1)。使用RNA isolater total RNA extraction reagent试剂盒(南京诺唯赞公司)提取K326的总RNA。使用Universal RT-PCR Kit(M-MLV)试剂盒(北京索莱宝公司)进行反转录实验,得到K326的cDNA 产物。以反转录得到的cDNA 为模板进行PCR 扩增。PCR 扩增条件为:94℃5 min,94℃30 s,50℃45 s,72℃106 s,30个循环,72℃10 min,16℃30 min。将扩增得到的目的基因与pBWA(V)HS 载体连接后,送武汉伯远生物科技有限公司检测,得到目的基因的序列信息。

表1 RT-PCR 和定量扩增引物序列Table 1 Primer sequences of RT-PCR and quantification amplifications

1.2.2 序列分析方法

用NCBI网站上的ORF finder将目的基因序列翻译成氨基酸序列,再通过该网站上的CD search功能预测NtPHT2;1 蛋白的保守结构域。利用TMHMM2.0预测NtPHT2;1蛋白的跨膜结构域。用Expasy网站的ProParam 和PRABI网站的SOPM 分析NtPHT2;1蛋白理化性质和二级结构。用Net Phos-3.1 预测NtPHT2;1 蛋白质的磷酸化位点。用DNAMAN 软件进行蛋白质多序列比对。用MEGA 6.0软件制作系统发育树,比较烟草NtPHT2;1与其他物种PHT2;1的亲缘关系。

1.2.3 启动子分析

登录Sol Genomics Network网站,以烟草Nt-PH T2;1的CDS序列作为探针进行Blast搜索,得到Nt PHT2;1全长序列,选取Nt PHT2;1基因起始密码子上游2 500 bp 长度的核苷酸序列,利用PlantCARE网站分析启动子序列中所含的顺式元件。

1.2.4 亚细胞定位

根据烟草Nt PHT2;1基因序列设计带有酶切位点的特异引物,经PCR 扩增后,将带有目的基因长度的电泳片段切下进行溶胶回收,PCR 产物检测无误后与酶切后的p BWA(V)HS-GLosgfp载体进行连接反应;将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态,选取阳性克隆进行测序验证,获得融合载体pBWA(V)HS-NtPHT2;1-GLosgfp。提取质粒转化至GV3101农杆菌感受态细胞中,用注射器吸取经验证过的阳性农杆菌液注射到K326十字期的叶片中,将转入融合载体的烟苗放置于培养箱(28℃)培养2～3 d。利用激光共聚焦显微镜观察荧光蛋白在烟草表皮细胞中的位置,用未插入Nt PH T2;1基因的p BWA(V)HS-Glosgfp空载体作为对照。

1.2.5 基因表达分析

使用BalbStart SYBR qPCR Ultra Mix(上海联迈生物工程有限公司)试剂盒进行qRT-PCR 检测,以烟草组成型表达基因NtL25(GenBank:L18908.1)作为内参基因,试验重复3次。采用计算目的基因相对表达量[21]。

1.2.6 数据分析

用IBM SPSS Statistics 25软件进行单因素完全随机试验统计分析,LSD 法进行多重比较,用Origin 2021软件制作基因相对表达量柱状图。

2 结果与分析

2.1 NtPHT2;1 基因PCR扩增电泳结果

以K326 的cDNA 为模板进行PCR 扩增(图1),得到1条在1 500～2 000 bp之间的PCR 产物。进一步对克隆得到的Nt PH T2;1全长序列进行测序分析,显示该基因的序列全长为1 764 bp,可编码587个氨基酸。

M.DL 5000 DNA marker;1.cDNA。图1 烟草NtPHT2;1 基因PCR 扩增电泳图谱Fig.1 The electrophoretic map of PCR amplification of the tobacco N t PHT2;1 gene

2.2 NtPHT2;1 基因的生物学分析

2.2.1 NtPHT2;1蛋白结构分析

为了了解NtPHT2;1蛋白质结构序列特征,对该蛋白进行分析发现,其分子式为C2828H4423N723O800S22,相对分子质量为62 056.91 D,等电点为9.00,不稳定指数(Ⅱ)为26.70,属于稳定蛋白。利用PRABI网站的SOPM 功能分析烟草NtPHT2;1蛋白的二级结构(图2)发现,其二级结构中α-螺旋占38.84%,延长链占24.87%,β-转角占8.35%,无规则卷曲占27.94%。

图2 烟草NtPHT2;1蛋白二级结构分析Fig.2 Secondary structure analysis of tobacco NtPHT2;1 protein

磷酸化位点预测如图3所示,NtPHT2;1蛋白中有17个苏氨酸(Thr)、42个丝氨酸(Ser)和2个酪氨酸(Tyr)高出阈值(Threshold),推测这些位点可能发生磷酸化。对烟草NtPHT2;1蛋白进行保守结构域预测,表明该蛋白含有1个PHO4超家族结构域(图4)。

图3 烟草NtPHT2;1蛋白磷酸化位点预测Fig.3 Phosphorylation sites prediction of tobacco NtPHT2;1 protein

图4 烟草NtPHT2;1蛋白保守结构域Fig.4 Conserved domain of tobacco NtPHT2;1 protein

2.2.2 NtPHT2;1蛋白跨膜结构域分析

NtPHT2;1 蛋白跨膜结构域分析结果如图5所示,通过纵坐标轴的数值反映氨基酸(横轴)位于膜内外两侧和跨膜螺旋区的概率。结构域分析预测结果显示,NtPHT2;1 蛋白含有11 个跨膜螺旋结构,在TM8和TM9 之间有1个中央亲水环,将其分隔为2 组,符合PHT2;1 家族蛋白共有的结构特征。

图5 NtPHT2;1蛋白跨膜结构域分析Fig.5 Transmembrane domain analysis of NtPHT2;1 protein

2.2.3 NtPHT2;1同源性与系统发育树分析

在NCBI上查找烟草、拟南芥、水稻和辣椒等植物PHT 家族成员氨基酸序列,与烟草NtPHT2;1蛋白氨基酸序列进行同源性分析(图6),其中Nt-PHT2;1与NtPHT1;2和NtPHT1;4的同源性分别为9.20%和10.88%;与拟南芥At PHT2;1的同源性达到68.56%;与水稻OsPHT2;1的同源性达到66.27%;与同属茄科作物的辣椒CaPHT2;1的同源性最高达到91.00%。系统发育树(图7)表明,烟草NtPHT2;1与辣椒CaPHT2;1的亲缘关系最为接近,与拟南芥AtPHT1;4和烟草NtPHT1;2的亲缘关系最远,这与氨基酸序列同源性分析结果一致。

图6 烟草NtPHT2;1蛋白氨基酸序列同源性分析Fig.6 Homology analysis of the amino acid sequence of tobacco NtPHT2;1 protein

2.3 NtPHT2;1 基因启动子分析

在Nt PHT2;1前面截取1段长2 500 bp的启动子序列进行启动序列分析(图8),NtPHT2;1启动子含有2个参与厌氧诱导的顺式作用元件(ARE);2个参与脱落酸反应的顺式作用元件(ABRE);1个参与水杨酸反应的顺式作用元件(TCA-element);1个参与赤霉素反应的顺式作用元件(GARE-motif);1个WRKY转录因子的结合位点(W-BOX);2个不同响应光信号的顺式作用元件(GT1-motif和I-box);1个参与防御和应激响应的顺式作用元件(TC-rich repeats)。根据这些顺式元件的作用,推测NtPHT2;1与植物衰老、逆境胁迫和光合作用有关。

ABRE.参与脱落酸反应的顺式作用元件;W-box.转录因子WRKY 家族成员的结合位点;GT1-motif.参与响应光信号的顺式作用元件;ARE.参与厌氧诱导所必需的顺式作用元件;TCA-element.参与水杨酸反应的顺式作用元件;I-box.参与响应光信号的顺式作用元件;GARE-motif.参与赤霉素反应的顺式作用的原元件;TC-rich repeats.参与防御和应激响应的顺式作用元件。图8 NtPHT2;1 基因启动子顺式元件分析ABRE,cis-acting element involved in abscisic acid reaction.W-box,binding sites for members of the WRKY family of transcription factors.GT1-motif,cis-acting element involved in responding to optical signals.ARE,cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction.TCA-element,cis-acting element involved in salicylic acid reaction.I-box,cis-acting element involved in responding to optical signals.GARE-motif,cis-acting primitive element involved in gibberellin reaction.TC-rich repeats,cis-acting elements involved in defense and stress response.Fig.8 Cis-element analysis of the promoter of Nt PH T2;1 gene

2.4 NtPHT2;1蛋白亚细胞定位

利用GV3101 农杆菌体将融合表达载体pBWA(V)HS-NtPHT2;1-GLosgfp 转化至烟草表皮细胞中,在激光共聚焦显微镜下观察叶片荧光信号,结果如图9所示,结合叶绿体荧光蛋白通道与叠加场的结果发现转入pBWA(V)HS-NtPHT2;1-GLosgfp质粒的荧光存在于叶绿体上,表明Nt-PHT2;1蛋白定位于细胞的叶绿体上。

图9 亚细胞定位结果分析Fig.9 Subcellular localization analysis

2.5 NtPHT2;1 表达模式分析

2.5.1 不同磷浓度处理下NtPHT2;1的组织表达模式分析

Nt PHT2;1在CK 下和LP 下的组织表达特性如图10所示,可以看出Nt PHT2;1主要在叶片中表达,且在新叶中的表达量最高。正常处理下,Nt PH T2;1在新叶中的相对表达量与老叶、茎、根相比,分别增加了3.02,49.29,1 289.82倍。在低磷处理下,Nt PHT2;1在茎、新叶和老叶中的相对表达量均有所减少但差异不显著,以上3个组织的相对表达量与正常处理相比分别下降了4.00%、7.62%和6.49%。整体来看,低磷胁迫抑制了Nt-PHT2;1基因的表达。

不同小写字母表示在处理间差异显著,不同大写字母表示组织间差异显著(P<0.05)。下同。图10 低磷胁迫下Nt PHT2;1 的组织表达模式Different lowercase letters indicate significant differences between treatments,while different capital letters indicate significant differences between tissues(P<0.05).The same as below.Fig.10 Expression of NtPHT2;1 gene in different tissues under low phosphorus stress

2.5.2 不同非生物胁迫下NtPHT2;1相对表达水平分析

为了探究Nt PH T2;1在不同非生物胁迫下的基因相对表达量,以正常培育处理为对照,设置了低温、盐胁迫和干旱3个非生物胁迫处理,通过qRTPCR技术检测不同处理下Nt PH T2;1的相对表达量(图11),结果表明Nt PHT2;1在盐胁迫和干旱胁迫下的相对表达量显著降低,而低温胁迫下的相对表达量与正常处理略高于对照,但不存在显著性差异,整体来看Nt PH T2;1受盐胁迫和干旱胁迫诱导表达减弱。

图11 不同非生物胁迫下Nt PHT2;1基因的相对表达量Fig.11 Relative expression of Nt PHT2;1 gene under different abiotic stresses

3 讨论

烟草Nt PHT2;1基因作为烟草中唯一1个被克隆的PHT2家族成员,其编码的磷转运蛋白为低亲和磷转运蛋白。由于低亲和磷转运蛋白对磷元素的吸收利用能力远不如高亲和磷转运蛋白,因而对烟草PHT2家族成员的研究远不如PHT1家族[22]深入。本文从普通烟草品种K326 中克隆出Nt-PHT2;1基因,对NtPHT2;1蛋白进行生物信息学分析。结果表明该NtPHT2;1蛋白含有587个氨基酸,等电点(pI)为9.00,包含11个跨膜疏水区,在TM8和TM9之间有1个中央亲水环,这与拟南芥AtPHT2;1蛋白和水稻OsPHT2;1蛋白的跨膜结构分析结果[11,15]一致。氨基酸序列比对发现,烟草NtPHT2;1与辣椒CaPHT2;1同源性最高达到91.00%。从系统发育树可看出,NtPHT2;1 与辣椒CaPHT2;1在同一个分支上,表明两者亲缘关系最近。亚细胞定位显示,NtPHT2;1蛋白定位于叶绿体上,这与拟南芥、小麦等植物中的研究结果[11,14]相同。对烟草NtPHT2;1启动子上的顺式元件分析发现,上面含有多个响应激素反应、防御和应激反应、光信号诱导的顺式作用元件,还含有WRKY 转录因子的结合位点(W-BOX)。WRKY转录因子的研究表明,WRKY 转录因子能与WBOX元件相结合来响应植物低磷胁迫过程,并且该转录因子与植物的逆境应答和叶片衰老等生理活动密切相关[23-25]。因此,推测Nt PHT2;1与植物衰老、逆境胁迫和光合作用有关。

目前关于PHT2 家族基因的研究结果表明,PH T2;1基因在不同的植物中具有不同的表达模式,例如,小麦和水稻中该基因的表达量在低磷和光照条件下都显著提高[14-15];苜蓿Mt PH T2;1在叶片中的表达量受光诱导显著增加,但低磷胁迫条件下,其表达量明显受到抑制[13];拟南芥在低磷胁迫下,At PHT2;1在叶片部位的表达量无显著性变化,但在根部的表达量略有增加[26]。虽然这些研究揭示PHT2;1基因具有不同的表达模式,但这些研究都表明PH T2;1基因主要在叶片中表达,在根部微弱表达。对Nt PHT2;1在烟草不同组织的表达特征分析发现,该基因主要在叶片中表达,尤其是新叶中的相对表达量最高,在根部几乎不表达。在低磷处理下,Nt PH T2;1在茎、新叶和老叶中的相对表达量均有所降低,但差异不显著,这与拟南芥At-PH T2;1表达模式[26]相似。结合Nt PH T2;1的组织表达模式和亚细胞定位结果,推测NtPHT2;1蛋白可能负责将细胞质中的磷酸盐转运至叶绿体内,进而影响叶绿体的合成和叶片的发育。前面的启动子分析发现,Nt PH T2;1可能与烟草抵抗逆境胁迫有关,但对Nt PHT2;1在不同非生物胁迫下的表达模式分析发现,该基因在盐胁迫和干旱胁迫下的相对表达量显著降低,而在低温胁迫下的相对表达量略有升高,故推测Nt PH T2;1对磷酸盐的转运和再利用可能涉及其他复杂的信号传导过程。因此,非生物胁迫下Nt PH T2;1的表达模式和分子机理还需要进一步探究。

4 结论

该研究克隆了烟草Nt PH T2;1基因,对其编码蛋白NtPHT2;1进行生物信息学分析,证实该蛋白具有PHT2家族蛋白的共同特征。同时,对Nt-PHT2;1的表达模式分析发现,该基因主要在烟草叶片中表达,在根部几乎不表达。在低磷胁迫下,该基因在茎、新叶和老叶中的相对表达量均有所降低,但差异不显著;但在盐胁迫和干旱胁迫下,该基因的相对表达量显著降低。推测Nt PHT2;1主要参与烟草对磷酸盐的转运过程,并在调控非生物胁迫下烟草对磷酸盐的转运过程中发挥关键作用。在后续研究中需要创制NtPHT2;1的过表达和敲除材料,对其进行低磷等非生物胁迫处理,验证各处理对不同株系的生理指标和NtPHT2;1基因表达模式的影响,来进一步揭示NtPHT2;1对磷酸盐的调控机制,为后续烟草磷高效利用新品种的培育提供依据。