王彩媚，林嗣翔，王 淼

（广东省药品检验所·国家药品监督管理局药用辅料质量控制与评价重点实验室，广东 广州 510663）

枸橼酸三乙酯又称柠檬酸三乙酯，化学名为2，2'-羟基-1，2，3-丙烷三羧酸三乙酯［1］，常用于胶囊剂、片剂、微丸、颗粒剂、膜剂、涂膜剂、透皮治疗系统等的制备。枸橼酸三乙酯由枸橼酸和乙醇在催化剂条件下高温反应制得［2-4］，反应物和反应系统均可能带来潜在的重金属元素杂质。重金属元素对人体的心、脑、肺、肾、肝、胃肠道、神经系统、免疫系统、生殖器官等均可能造成损伤［5］，各国药品监管机构越来越重视元素杂质的控制。2017 年2 月，人用药品技术要求国际协调理事会（ICH）颁布了原料药、制剂元素杂质研究指导原则（ICH Q3D）［6］，列出了各元素杂质在不同给药途径下的允许浓度值。2020 年版《中国药典（四部）》［1］在质量标准中利用重金属比色法控制重金属元素杂质，但目前已无法满足元素杂质的精准控制需要。《美国药典》于2018 年更新了通则方法<232 >和<233 >［7］，以替换通则方法<231 >（比色法）［8］。我国于2017 年加入ICH，国家药典委员会已在积极推进ICH 各个杂质指导原则在我国的实施，其中包括ICH Q3D［9］。电感耦合等离子体-质谱（ICP-MS）法测定痕量元素杂质的专属性和灵敏度高，且可同时快速测定多种元素杂质［10-14］。本研究中建立了测定枸橼酸三乙酯中镉（Cd）、铅（Pb）、砷（As）、汞（Hg）、钴（Co）、钒（V）、镍（Ni）7种元素杂质残留量的ICP-MS 法，初步考察和评估我国枸橼酸三乙酯中各元素杂质的风险，为ICH Q3D 在我国的逐步实施提供参考数据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 7900型电感耦合等离子体质谱仪（美国Agilent公司）；ETHOS One型微波消解仪（美国Melestone公司）；ED16型电热赶酸器（北京莱伯泰科仪器公司）；CP225D型电子天平（德国Satorius公司，精度为十万分之一）。

1.2 试药

枸橼酸三乙酯（编号为1-23；涉及10家生产企业，编号为A-J）；V，Co，Ni，As，Cd，Pb 元素混合标准溶液（批号为51-042CRY2，质量浓度均为10 µg/mL），Hg单元素标准溶液（批号为12-20HGY2，质量浓度为10 µg/ mL），钪（Sc）、铟（In）、锗（Ge）、铋（Bi）元素混合标准溶液（批号为5190-9770，质量浓度分别为10，5，5，5µg/mL），均购自美国Agilent Technologies 公司；金（Au）单元素标准溶液（国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院，批号为170523631，质量浓度为1 000µg/mL）；65%硝酸（德国Merck 公司）；30%过氧化氢溶液（广东光华科技股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 质谱条件

载气：氦气；等离子体模式：HMI-8；采样深度：10.0 mm；射频功率：1 600 W；载气流量：0.8 L/min；雾化气流量：0.8 L/min；辅助气流量：0.8 L/min；等离子气流量：15.0 L/min；蠕动泵转速：0.10 r/min；雾化室温度：2 ℃。

2.2 溶液制备

Au 保护溶液：精密量取Au 单元素标准溶液（质量浓度为1 000 µg/ mL）100 µL，置100 mL 容量瓶中，加2%硝酸溶液稀释并定容，制成质量浓度为1.0µg/mL的Au保护溶液。

供试品溶液：取样品0.5 g，精密称定，置消解罐中，精密加入Au保护溶液0.2 mL，加入硝酸5 mL及30%过氧化氢溶液2 mL，盖上内盖，旋紧外盖，按仪器操作说明书缓慢升至180 ℃消解1 h，放冷，旋开外盖，取下内盖，将消解罐置赶酸器上于100 ℃加热赶酸，至溶液剩余约3 mL，用2%硝酸溶液定量转移至50 mL容量瓶中，加2%硝酸溶液稀释并定容，摇匀，作为供试品溶液。

空白溶液：按供试品溶液制备方法制备不含样品的空白溶液。

标准贮备液：精密量取V，Co，Ni，As，Cd，Pb 元素混合标准溶液适量，用2%硝酸溶液稀释为每1 mL含各元素500 ng的混合溶液，即得标准贮备液Ⅰ；精密量取Hg单元素标准液适量，用2%硝酸溶液稀释为每1 mL 含Hg元素100 ng的溶液，即得标准贮备液Ⅱ。

标准曲线混合线性溶液：精密量取标准贮备液Ⅰ和Ⅱ各适量，用3%硝酸溶液分别稀释为每1 mL 含Cd，Pb，As，Co，V，Ni元素0，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 ng及含Hg元素0，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 ng的系列溶液。

内标溶液：精密量取Sc，Ge，In，Bi元素混合标准溶液5 mL，置50 mL 容量瓶中，用2%硝酸溶液定容，制成含Sc，Ge，In，Bi 质量浓度分别为1.0，0.5，0.5，0.5µg/mL的内标溶液。空白溶液、标准溶液和供试品溶液都通过仪器在线加入内标溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察：取2.2项下系列标准曲线混合线性溶液适量，按2.1 项下质谱条件进样测定，以各元素质量浓度（X，ng/mL）为横坐标、仪器响应值（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表1，表明Cd，Pb，As，Co，V，Ni元素的质量浓度在0～20 ng/mL 范围内，Hg 元素的质量浓度在0～5.0 ng/mL范围内，与仪器响应值线性关系良好（r≥0.999 5，n=7）。

表1 线性关系考察、检测限和定量限确定、精密度试验结果Tab.1 Results of the linear relation test，LOD，LOQ，and the precision test

检测限和定量限确定：取2.2 项下空白溶液适量，按2.1 项下质谱条件连续进样测定15 次，以响应值的3 倍标准偏差（3SD）所对应的质量浓度作为检测限，以响应值的10 倍标准偏差（10SD）所对应的质量浓度作为定量限。结果见表1。

精密度试验：取2.2项下标准曲线混合线性溶液的中间质量浓度（Cd，Pb，As，Co，V，Ni 元素的质量浓度为2.0 ng/mL，Hg 元素的质量浓度为0.5 ng/mL），按2.1项下质谱条件重复进样测定6次。结果见表1，表明仪器精密度良好。

加样回收试验：取样品（编号为1）0.5 g，精密称定，共9 份，分别加入标准贮备液Ⅰ0.8，1.0，1.2 mL 及标准贮备液Ⅱ0.4，0.5，0.6 mL，各3 份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下质谱条件进样测定。结果见表2。

表2 7种元素杂质加样回收试验结果（%，n=9）Tab.2 Results of the recovery test of seven elemental impurities（%，n=9）

2.4 样品中元素杂质残留量测定

取23 批（编号为1-23）样品，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下质谱条件分别进样测定。参考ICH Q3D（R2）［6］，As，Cd，Hg，Pb，V，Co，Ni 的允许浓度分别为1.5，0.5，3，0.5，10，5，20 µg/g，以允许浓度的30%设定控制阈值，分别为0.45，0.15，0.9，0.5，10，5，20µg/g。结果样品中元素杂质As，Cd，Hg，Pb，V，Co，Ni的检测限分别为0.000 7，0.000 8，0.001 5，0.001 7，0.000 002，0.01，0.005µg/g，含量远低于控制阈值，表明枸橼酸乙酯中元素杂质残留量均处于较低水平。详见表3。

表3 样品中7种元素杂质残留量测定结果（µg/g）Tab.3 Determination results of residual quantity of seven elemental impurities in samples（µg/ g）

3 讨论

3.1 样品前处理

枸橼酸三乙酯属小分子有机化合物，湿法消解时无须浸泡过夜即可消解完全；测定Hg元素时，消解后的赶酸温度不宜过高，应不超过100 ℃。

3.2 元素杂质选择

ICH Q3D 将元素杂质分为3 类。第一类元素为As，Hg，Pb，Cd，该类元素为人体毒素，在药品生产中应限制使用或禁用，在所有给药途径的药物中均需考察。第二类元素杂质的毒性与给药途径有关，分为2 个亚类。其中，2A 类V，Co，Ni，由于这些元素具有较高的自然丰度，所有给药途径的药物均需对其潜在来源进行评估；2B 类Ag，Au，Pb 及铱（Ir）、锇（Os）、铂（Pt）、铑（Rh）、钌（Ru）、硒（Se）、铊（Tl），这些元素的丰度较低，出现在药品中的概率较低，除非有意添加，否则无需进行风险评估［2］。因此，本研究中选择第一类、第2A 类元素作为考察和评估对象。

3.3 风险评估

目前，药品风险评估的重点是结合ICH Q3D 中的每日允许暴露量（PDE）评估药品中元素杂质的水平。PDE 值代表每日最大给药剂量的药品中每个元素的最大日允许摄入量（µg/d）。不同给药途径的元素杂质的PDE 值不同，枸橼酸三乙酯属口服制剂用药用辅料，其元素杂质PDE 值按口服给药途径进行风险评估。但PDE 值仅反映来自药品的总暴露量，需将PDE 值转换为浓度，作为一种评估药品或其组分中元素杂质含量的工具。按公式计算允许浓度，允许浓度（µg/g）=PDE/药品日剂量。

ICH Q3D 将药品既定PDE 值的30%定义为控制阈值，作为实测元素杂质水平显著性的衡量指标，控制阈值可用于判断是否需要额外控制。若药品中所有来源的总元素杂质水平始终低于PDE 的30%，则不再需要额外控制；若风险评估无法证明某个元素杂质水平始终低于控制阈值，则需建立控制方法以保证药品中元素杂质水平不超过PDE。由表3 可知，本研究中的23 批样品中Cd，As，Hg，Co，V，Ni，Pb 7 种元素杂质的含量均低于控制阈值，表明安全风险较低。