贾文瑞，聂安政

（郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052）

细辛来源于马兜铃科植物汉城细辛（Asarum sieboldiiMiq.var.seoulense Nakai）、北细辛［Asarum heterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum（Maxim.）Kitag.］或华细辛（AsarumsieboldiiMiq.）的干燥根和根茎［1］。《神农本草经》细辛项下记载：“主咳逆上气，头痛脑动，百节拘挛，风湿痹痛”［2］。《中华本草》曰：“细辛祛风散寒，通窍止痛，温肺化饮”，可用于风寒头痛，牙痛，痹痛，咳喘痰稀等证［3-4］。临床多用于治疗牙痛、坐骨神经痛、顽固性三叉神经痛及类风湿性关节炎等疾病［5-7］。笔者前期研究发现，细辛具有抗炎镇痛作用，而细辛挥发油是其主要化学成分，因此本研究以醋酸刺激痛、热刺激痛、福尔马林刺激痛实验和二甲苯致小鼠耳肿胀实验对细辛挥发油进行镇痛抗炎作用研究，初步探讨细辛挥发油镇痛作用机制。

1 材料

1.1 动物

250只昆明小鼠，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，生产许可证号：SCXK（京）2020-0004，体质量18～22 g，雌雄各半。饲养条件：室内温度（23±1）℃，湿度（45±5）%，标准12 h光照/12 h黑暗节律，普通清洁剂、鼠饲料与饮水。

1.2 药品及试剂

细辛来源于郑州大学第一附属医院药房，由郑州大学第一附属医院中医药学部王娟教授鉴定为马兜铃科植物华细辛（AsarumsieboldiiMiq.）的根及根茎。

二甲苯（上海麦克林生化科技有限公司，批号：20150508）；冰醋酸（上海麦克林生化科技有限公司，批号：920827）；吐温-80（天津市风船化学试剂科技有限公司，批号：20211013）；阿司匹林（拜耳医药保健有限公司，批号：J2022021）；福尔马林（湖南尔康制药股份有限公司，批号：H43020198）；荷包牡丹碱（上海源叶生物科技有限公司，批号：J21HB174671）。

1.3 仪器

打孔器（上海泽雅科教仪器有限公司，型号：INS500075-5）；电子天平（上海力辰仪器科技有限公司）；酶标仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，型号：MR-96A）。

2 方法

2.1 细辛挥发油及给药溶液的制备

取适量细辛，加入10倍量的蒸馏水浸泡1 h，采用水蒸气蒸馏法提取细辛挥发油，提取4 h，将提取出来的挥发油密封避光并冷藏保存。取适量挥发油用1%吐温-80配制1.2、0.6 g/mL的溶液；取阿司匹林用1%吐温-80配制15 mg/mL的溶液。

2.2 醋酸扭体实验

取昆明小鼠40只，适应性饲养5～7 d后按体质量随机分为4组，即对照组（吐温-80组）、阿司匹林组和细辛挥发油高、低剂量组，每组10只，雌雄各半。阿司匹林组小鼠灌胃300 mg/kg阿司匹林，细辛挥发油高、低剂量组小鼠分别灌胃24、12 g/kg（相当于生药量）细辛挥发油，对照组小鼠给予吐温-80，各组给药量均为20 mL/kg。每日灌胃1次，连续灌胃3 d，末次灌胃1.5 h后小鼠腹腔注射0.6%的醋酸0.2 mL，观察并记录15 min内每组小鼠扭体次数，并计算抑制率（%）。

抑制率（%）=（对照组扭体次数-给药组扭体次数）/对照组扭体次数×100%

2.3 福尔马林实验

动物分组及给药同“2.2”项，末次灌胃给药后1.5 h，昆明小鼠分别右后足底注射给予2.5%的福尔马林溶液20 μL，观察并记录1 h内小鼠舔足和咬足的持续时间。Ⅰ相反应为0～5 min舔足和咬足的持续时间；Ⅱ相反应为10～60 min内舔足和咬足的持续时间。

2.4 热板实验

动物分组与给药同“2.2”项，热板温度调整至55.5 ℃，于灌胃前、末次灌胃1、2、3 h后分别测量并记录小鼠痛阈值。

2.5 耳廓肿胀实验

动物分组与给药同“2.2”项，末次灌胃1 h后将0.05 mL二甲苯均匀涂抹于小鼠右耳的两面，左耳对应位置涂抹等体积的生理盐水，0.5 h后脱颈椎处死小鼠，将小鼠左右两耳剪下，叠放对齐，用打孔器在左右耳相同部位打孔，取下称重。

肿胀度（g）=右耳质量-左耳质量

2.6 受体阻断实验

取昆明小鼠60只，分两批，每批30只，适应性饲养5～7 d后按体质量随机分别分为3组，即生理盐水/1%吐温-80组、生理盐水/细辛挥发油组、荷包牡丹碱/细辛挥发油组，每组10只，雌雄各半。生理盐水/1%吐温-80组小鼠腹腔注射生理盐水预处理，15 min后灌胃给予1%吐温-80；生理盐水/细辛挥发油组小鼠腹腔生理盐水注射预处理，15 min后灌胃给予细辛挥发油（24 g/kg）；荷包牡丹碱/细辛挥发油组小鼠腹腔注射荷包牡丹碱（3 mg/kg）预处理，15 min后灌胃给予细辛挥发油（24 g/kg）。用热板法（方法同“2.4”项）测定给药后1、2、3 h小鼠潜伏期；用醋酸扭体法（方法同“2.2”项）观察记录小鼠扭体的次数。

2.7 血清NO检测实验

取昆明小鼠30只，适应性饲养5～7 d后按体质量随机分为3组，即正常组、吐温-80组、细辛挥发油组，每组10只，雌雄各半。末次给药1.5 h后，小鼠腹腔注射0.6%醋酸（正常组除外），每只0.2 mL，15 min后，小鼠摘眼球取血，室温静置1 h，4 ℃离心，3 000 r/min离心10 min，取上清，严格按NO试剂盒说明操作。

2.8 统计学方法

采用SPSS19.0统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，不同分组之间进行单因素方差分析比较组间差异；各组方差齐性条件下采用Bonferroni法进行两两比较，各组方差不齐情况下采用Dunnett's T3法进行两两比较。P＜ 0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 细辛挥发油对醋酸扭体小鼠的影响

与吐温-80组比较，阿司匹林组和细辛挥发油高、低剂量组小鼠扭体次数显著降低（P＜ 0.01），抑制率分别为59.6%，57.8%、34.8%。见表1。

表1 各组小鼠醋酸扭体实验结果比较

3.2 细辛挥发油对福尔马林致疼痛小鼠的影响

与吐温-80组比较，阿司匹林组、细辛挥发油低剂量组Ⅰ相舔足时间显著降低（P＜ 0.05）；阿司匹林组、细辛挥发油高、低剂量组小鼠Ⅱ相舔足时间降低（P＜0.01），抑制率分别为51.73%、52.93%、37.33%。见表2。

表2 各组小鼠福尔马林致疼痛实验结果比较

3.3 细辛挥发油对热板小鼠的影响

与吐温-80组比较，阿司匹林组1、2、3 h热痛潜伏期显著延长（P＜ 0.01），细辛挥发油高剂量组1 h热痛潜伏期延长，2、3 h热痛潜伏期显著延长（P＜ 0.05，P＜ 0.01），细辛挥发油低剂量组2 h的热痛潜伏期均显著延长（P＜ 0.01）。见表3。

表3 各组小鼠热板实验结果比较（±s，s）

表3 各组小鼠热板实验结果比较（±s，s）

注：与吐温-80组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。

组别吐温-80组阿司匹林组细辛挥发油高剂量组细辛挥发油低剂量组n 剂量/（g/kg）—0.3 24 12基础潜伏期12.67±3.67 12.54±4.19 12.13±2.47 12.13±0.92潜伏期3 h 11.98±3.67 16.34±1.63**16.89±4.90*14.38±3.94 10 10 10 10 1 h 12.23±3.58 20.54±1.27**15.26±2.94 13.54±3.24 2 h 12.12±2.71 18.54±1.72**21.32±6.81**17.65±2.96**

3.4 细辛挥发油对耳廓肿胀小鼠的影响

与吐温-80组比较，阿司匹林组和细辛挥发油高、低剂量组小鼠耳廓肿胀度显著降低（P＜ 0.01），抑制率分别为77.13%，82.09%、63.79%。见表4。

表4 各组小鼠耳廓肿胀实验结果比较

3.5 荷包牡丹碱对细辛挥发油作用的影响

3.5.1 对抗醋酸刺激痛作用的影响

与生理盐水/吐温-80组比较，生理盐水/细辛挥发油组小鼠1、2、3 h热痛潜伏期显著延长（P＜0.01）；荷包丹碱处理后给予细辛挥发油，荷包牡丹碱/细辛挥发油组小鼠较生理盐水/细辛挥发油组1、2、3 h热痛潜伏期显著缩短（P＜ 0.01，P＜ 0.05）。见表5。

表5 荷包牡丹碱对细辛挥发油抗醋酸刺激痛作用的影响（±s，s）

表5 荷包牡丹碱对细辛挥发油抗醋酸刺激痛作用的影响（±s，s）

注：生理盐水/吐温-80组比较，**P ＜ 0.01；与生理盐水/细辛挥发油组比较，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

组别生理盐水/吐温-80组生理盐水/细辛挥发油组荷包牡丹碱/细辛挥发油组n 基础潜伏期10.43±1.11 10.40±2.04 10.36±2.97潜伏期3 h 10.43±1.11 14.46±3.24**11.76±2.14#10 10 10 1 h 10.98±1.78 13.64±1.32**11.49±1.85##2 h 10.63±2.05 16.90±1.63**12.30±2.34##

3.5.2 对醋酸扭体作用的影响

与生理盐水/吐温-80组比较，生理盐水/细辛挥发油组小鼠扭体次数显著减少（P＜ 0.01）；荷包丹碱处理后给予细辛挥发油，荷包牡丹碱/细辛挥发油组小鼠较生理盐水/细辛挥发油扭体次数显著增加（P＜0.01）。见表6。

表6 荷包牡丹碱对细辛挥发油抗醋酸扭体作用的影响

3.6 细辛挥发油对醋酸致痛小鼠血清NO的影响

与正常组比较，吐温-80组小鼠血清NO水平显著升高（P＜ 0.01）；细辛挥发油剂量组NO水平较吐温80组显著降低（P＜ 0.01），见表7。

表7 细辛挥发油对醋酸致痛小鼠血清NO的影响（±s）

表7 细辛挥发油对醋酸致痛小鼠血清NO的影响（±s）

注：正常组比较，**P ＜ 0.01；与吐温-80组比较，##P ＜ 0.01。

组别正常组吐温-80组细辛挥发油组NO水平10.77±0.99 18.07±0.79**12.47±0.70##n 剂量/（g/kg）10 10 10——24

4 讨论

细辛效专力宏、临床优势明确，以其强烈的辛温走窜之性改善沉疴痼冷，用于多种顽症、难治之症，至今已应用于临床2000余年［8］。细辛始载于《神农本草经》，东汉《伤寒杂病论》记载含有细辛的方剂16首［9-10］；隋唐《备急千金要方》收载细辛内服汤剂6首；清代发现373首含细辛方剂［11］；而现行《国家医保目录》《中华人民共和国药典》《中医方剂大辞典》共收载含细辛方剂1 061种［12］。细辛的活性成分集中在挥发油中，如甲基丁香酚、细辛脂素等［7］。

醋酸扭体实验发现，阳性药阿司匹林可显著抑制小鼠扭体次数，抑制率为59.6%，高、低剂量的细辛挥发油均可显著抑制醋酸致扭体疼痛，高剂量细辛挥发油抑制率为57.8%，与阳性药阿司匹林作用相当，提示细辛挥发油具有较强的镇痛作用。福尔马林疼痛实验发现，阿司匹林可明显缩短小鼠舔足时间（抑制率51.73%），高、低剂量细辛挥发油均可明显缩短小鼠舔足时间，且高剂量细辛挥发油（抑制率52.93%）作用略强于阿司匹林，表明细辛挥发油镇痛作用强。热板实验显示，阿司匹林与高、低剂量细辛挥发油均可显著延长小鼠1、2、3 h热痛潜伏期，且给予细辛挥发油在2 h时小鼠的热痛潜伏期最长，提示细辛挥发油在2 h时镇痛作用最强。小鼠耳廓肿胀实验发现，阿司匹林可显著抑制小鼠耳廓肿胀度，抑制率77.13%；高、低剂量细辛挥发油可显著降低小鼠耳廓肿胀度，抑制率分别为82.09%、63.79%，提示细辛挥发油抗炎作用显著，作用强于阿司匹林。

GABAA受体是氯离子通道成员之一，在外周及中枢神经系统中均有广泛的分布，介导了多种生理功能的发挥，在控制神经元兴奋性方面发挥了重要的作用，与调节痛觉调制等密切相关［13-14］。NO是气体信号分子家族中重要的一员，作为第二信使参与许多生物效应和生理、病理过程，经典信号通路NO/cGMP的激活参与了不同水平神经系统对痛觉信号传递、加工过程，对疼痛的发展和维持有着重要的影响［15-16］。激活GABAA受体则可抑制NO/cGMP信号通路，荷包牡丹碱阻断GABAA受体后又可激活NO/cGMP信号通路［17］。在热刺激痛和醋酸刺激痛实验中，GABAA受体阻断剂荷包牡丹碱能明显阻断细辛挥发油的镇痛作用，表明细辛挥发油的镇痛作用与激动GABAA受体相关。腹腔注射醋酸致使小鼠血清NO升高，细辛挥发油可抑制致痛小鼠血清NO水平，表明细辛挥发油的镇痛作用与抑制NO释放有关。

综上，细辛挥发油成分有明显镇痛抗炎作用，其镇痛作用机制可能与激动GABA受体，抑制NO水平相关。