赵宇婷,杨宇晨 综述,蔡智慧 审校

1.内蒙古医科大学内蒙古临床医学院,内蒙古呼和浩特 010110;2.内蒙古自治区人民医院肿瘤内科,内蒙古呼和浩特 010017

近年来,胰腺癌发病率在国内外都呈现上升趋势,胰腺癌虽然不是高发癌种,但却是导致死亡的第7大癌种。胰腺癌的5年生存率约为10%,据有关数据显示,胰腺癌占我国肿瘤发病率的第9位,死亡率占第6位[1],其中,约90%为起源于腺管上皮的导管腺癌(PDAC),PDAC的5年生存率不足1%。有研究表明,胰腺癌存在早期诊断率、手术切除率和药物有效率低的“三低”特征,胰腺癌起病隐匿,早期症状不典型,常表现为消化不良、腹泻、上腹部不适或腰背部疼痛等症状,易与其他消化系统疾病混淆而不能及时诊治[2]。不过有研究表明,从胰腺癌发生病变到进展为转移性胰腺癌要近21年的时间[3],这为胰腺癌早期筛查提供了较长的时间窗。

胰腺癌早期诊断的关键在于尽早确诊小胰腺癌,但迄今尚无统一的诊断标准,美国癌症分期委员会将肿瘤最大径≤2 cm且无区域淋巴结及远处转移的早期肿瘤称为小胰腺癌,TNM分期为ⅠA期[4]。另外,还有学者将最大径≤1 cm的胰腺癌定义为微小胰腺癌,术后5年生存率可达到67%[5]。临床上胰腺癌早期诊断的目的就是发现早期胰腺癌或小胰腺癌,以便早期手术治疗改善预后。若胰腺癌已非早期或最大径>2 cm,则其生存率明显降低[6]。有数据显示,0期(原位)患者的5年生存率为85.8%,ⅠA期患者的5年生存率为68.7%[7],而发展到中、晚期,失去了最佳治疗时机,5年生存率仅为10%[8],生存时间差异明显。因此及早筛查并诊治胰腺癌至关重要。

1 常规胰腺癌筛查手段

在胰腺癌传统检测方法中,计算机断层扫描(CT)、血管造影联合胸部和盆腔CT可用于评估血管解剖结构和疾病分期,是诊断时的常规治疗方法;磁共振成像和胰胆管造影可以用于判断胰腺病变是否有转移,并识别CT成像中可能表现不良的癌症;内镜超声检查可以更直接地显示胰腺肿块,明确细胞学或组织学诊断,确定肿瘤血管受累程度,评估区域淋巴结,并评估肿块完全切除的可能性,在内镜超声引导下对肿瘤进行细针穿刺活检,可以获得组织学诊断并为分子检测提供材料;糖类抗原(CA)199是胰腺癌公认的生物标志物,可用于监测治疗反应[9]。

然而,传统检测方法都存在一定缺陷,而无法作为可靠的早期筛查方法。如CT伴随着碘造影剂的肾毒性风险、辐射暴露风险,且在获得实质增强方面也存在个体差异而无法保证可靠性;内镜超声在某些国家或地区可用性较低,操作员技术差异较大,且无法检测到远处转移;磁共振成像因昂贵且禁忌使用某些金属植入物[10],且磁共振由于灵敏度(80%)和特异度低(75%)[11],可与其他疾病包括梗阻性黄疸、急性胆管炎和慢性胰腺炎混淆,易出现假阴性结果[12],所以目前磁共振可能并不能作为早期胰腺癌常规筛查的手段。总之,胰腺癌总体发病率较低,筛查成本高,在无症状人群中用上述方法进行筛查可能会带来过度诊断和假阳性的风险,因此需要更有效地富集高危人群使其在后续的监测中获益是胰腺癌筛查的关键,所以将液体活检作为早期筛查胰腺癌的方法引起了广泛讨论。

2 液体活检的应用优势

液体活检是一种基于血液、脑脊液、尿液、痰液、腹水和理论上任何其他体液采样的微创手术,正在成为用于早期癌症诊断、治疗、预后预测和随访的生物标志物[13]。作为非侵入性工具,液体活检可以从体液中获取肿瘤相关的重要信息,大多数重要信息都是从循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环肿瘤细胞(CTC)及细胞外囊泡的分析中收集的[14]。1994年首次报道了用等位基因特异性引物的PCR在胰腺癌患者的循环游离DNA(cfDNA)中检测到突变序列[15],由此提出,液体活检可应用于胰腺癌的临床应用中。在癌症早期筛查领域,液体活检相较传统检测方法有诸多优点。与传统的组织活检不同,液体活检是非侵入性操作,易于重复,并且可以方便地了解肿瘤负荷和治疗反应。此外,液体活检可以给出原发肿瘤的分子快照,从而最大限度地减少由采样偏重和肿瘤内异质性引起的活检结果偏倚[16]。因此在实体肿瘤早期筛查、监测疾病进展等方面均有巨大前景。

2.1CTC的特性及相关应用 CTC是血液中存在的恶性细胞,被认为是转移的“种子”。CTC从原发肿瘤脱落,通过血管系统到达第二个部位,若环境适宜,这些细胞便定居并增殖,从而形成转移性肿瘤[17]。因此推测CTC可能成为癌症转移的可靠生物标志物。目前CTC已被研究证实其可作为乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌的预后生物标志物[17]。但其在胰腺癌中的作用尚未得到广泛探讨。2004年CellSearch系统计数首次检测到CTC的存在,美国食品药品监督管理局评估了此系统对胰腺癌的诊断,结果准确度在11%～78.5%,检出率差异很大[18];随着新的功能测试模型的开发,更多用于体内检测和捕获CTC的设备为CTC研究开辟了新的途径,这可能会克服传统7.5 mL血液管(CellSearch系统)中CTC计数低的限制,从而提高检出率[19]。

早期CTC检测可识别胰腺癌转移风险增加的患者,可为手术或局部进展PDAC患者提供定制辅助治疗的机会。考虑到转移阶段通常发生在癌症进展的晚期,所以普遍认为在PDAC的癌前和早期阶段不会检测到CTC。但有研究发现,循环胰腺上皮细胞(CEC)仅在胰腺囊性病变和胰腺导管腺癌患者中发现,在体检健康者、PDAC患者和囊性病变患者中的CEC计数存在明显差异[20]。另一项研究也表明,CEC有可能对不同级别的导管内乳头状黏液性肿瘤(IPMN)和其他良性囊肿进行区别[17]。在PDAC的癌前阶段可以检测到CEC,因此提高了CTC作为早期诊断标志物的可能性。LEE等[12]使用GEDI芯片,分别在3个不同的受试组:PDAC组、胰腺癌癌前囊性病变(IPMN或黏液性囊性肿瘤)组及无癌组,分别检测CTC,结果显示,胰腺癌癌前囊性病变组、PDAC组和无癌组的CTC检出率分别为40%、73%和0%。但由于PDAC早期循环细胞数量较少且提取技术尚未完全成熟,CTC用于胰腺癌早期筛查仍需要更多的验证性研究。

除了早期筛查,近年来发现了CTC与胰腺癌在其他方面的相关性:(1)与预后相关,相对未检测到CTC的患者,检测到至少一种CTC的患者无进展生存时间更短;(2)CTC可能在评估晚期PDAC患者的治疗反应方面具有积极作用,经检测PDAC患者化疗后的CTC计数大幅减少[21];(3)判断肿瘤复发,CTC有上皮细胞和间充质细胞两种表型,且可表达波形蛋白,而波形蛋白是间充质细胞的一种标志物,与胰腺导管腺癌外科治疗后的高复发率有关[22];(4)监测化疗效果进而指导临床治疗,CTC计数在疾病晚期增加,所以如果检测到PDAC患者血液中CTC计数增加,即使影像学检查未检测到转移,也应考虑全身化疗而不是前期手术[23]。例如目前已有学者考虑采用分子生物标志物来预测呋喹替尼针对结直肠癌的疗效,未来应该设计并实施利用分子生物标志物预测免疫靶向治疗在胰腺癌疗效中的试验[24],并以此来指导、调整临床用药。

2.2ctDNA在胰腺癌中的应用 在体液环境中,可检测到一类游离的DNA片段,被称为cfDNA,cfDNA起源于肿瘤微环境的肿瘤和非肿瘤细胞[25],ctDNA是特异性来源于原发性或转移性肿瘤cfDNA的一部分,虽然ctDNA在cfDNA中具有较大的波动比例[26],但由于健康人群中大部分cfDNA的长度在70～200 bp,而肿瘤患者的ctDNA长度可能为200 bp甚至超过1 000 bp[27],这就可以对其进行定量定性分析,从而用于肿瘤监测。肿瘤DNA从原发肿瘤、CTC、微转移或明显转移到癌症患者的血液中释放,与肿瘤相关的基因缺陷模式(如点突变、重排、扩增、微卫星改变、表观遗传修饰等)就可以在血清和血浆中检测到,从而应用于临床肿瘤诊治过程。

相较CTC而言,ctDNA具有较高的特异性,ctDNA的特异性远高于CTC。原因可能是:(1)ctDNA通常在大量肿瘤细胞坏死后检测,此时肿瘤负荷已经很高;(2)PADC中的基因突变通常是特异性的[28]。

2.2.1ctDNA在胰腺癌早期筛查中的应用 作为液体活检的一种手段,ctDNA技术一般分为两种:基因突变检测和甲基化检测。

有研究记录了已知胰腺癌驱动基因的高突变频率,如鼠类肉瘤病毒癌基因(KRAS)、肿瘤抑制蛋白基因(TP53)、信号通路通用调节因子4 (SMAD4)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制基因(CDKN2A),其中KRAS突变被用于诊断监测中[29]。在一项研究中,与肿瘤组织序列相比,在26例胰腺癌症患者的ctDNA标本中评估了54个基因的突变,此项研究结果是KRAS、TP53、腺瘤性息肉病基因(APC)、F框/WD-40域蛋白7(FBXW7)和SMAD4这5个基因的ctDNA突变应该能够准确诊断PDAC[30]。KRAS是一种相对分子质量为21×103的小GTP酶,可激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号传导通路,从而控制与增殖、分化、迁移和存活相关的细胞过程[31]。1994年首次报道了用等位基因特异性引物的PCR在胰腺癌患者的血浆cfDNA中检测到突变的KRAS序列,对于每个胰腺癌患者,在血浆中发现的KRAS突变与在患者肿瘤中发现的一致,从而可以确认血浆中的突变DNA片段来自肿瘤,研究表明,cfDNA的突变是癌症的高度特异性标志物[15]。有数据显示在14.8%的体检健康者中也检测到了突变KRAS[32],该结果表明单独检测血浆KRAS突变并不能作为诊断胰腺癌的可靠标志物。有研究报道联合检测KRAS突变和CA199对胰腺癌的诊断灵敏度达91%,故与其他血清标志物联合检测,诊断灵敏度可明显提高[33]。

肿瘤在早期阶段其坏死和凋亡率较低,并且没有足够的ctDNA释放到循环中,所以灵敏度比较低[28]。近年来研究显示,cfDNA在癌变早期检测甲基化等表观遗传学改变方面具有很大的潜能。肿瘤发生早期DNA已经出现了甲基化的趋势或局部甲基化的改变,因此可以通过液体活检检测ctDNA的水平和甲基化特征来实现肿瘤的早期诊断及分期[34]。有研究通过评估cfDNA中两个基因[血小板反应蛋白基序1(ADAMTS1)、锌指蛋白basonuclin-1(BNC1)]的甲基化状态,结果发现其灵敏度为0.95,特异度为0.92,这种基于血液的微创生物标志物组合可以用作在选定的高危人群中进行诊断和筛查的有前途的工具[35]。除此之外,在另外一项初步研究中,结合cfDNA中5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)变化的模型实现了0.94的灵敏度和0.95的特异度,诊断PDAC的曲线下面积(AUC)为0.99,结果显示结合5mC和5hmC标记的特征模型优于两个单独的模型,特别是对PDAC的预测灵敏度有所提高,并且利用5hmC模型计算的加权诊断评分还可以区分Ⅰ期患者和Ⅱ～Ⅳ期患者[36]。一项针对靶向cfDNA甲基化的分析中,纳入了不同阶段的PDAC患者,发现Ⅰ期的灵敏度为0.63,Ⅱ期为0.83,Ⅲ期为0.75,Ⅳ期为1.00,cfDNA甲基化可能对监测风险群体非常有用[7]。使用新开发的称为珠子甲基化(MOB)的高度可靠的技术,EISSA等[35]发现A崩解素和金属蛋白酶与ADAMTS1、BNC1的甲基化及二者联合对胰腺癌诊断的灵敏度分别为87.2%、64.1%和97.4%。对于Ⅰ/Ⅱ期胰腺癌,二者联合检测表现出94.8%的灵敏度和91.6%的特异度。

2019年美国翰斯`·霍普金斯大学医学院开发了一种称为DELFI(早期拦截片段DNA)的方法,通过片段模式的全基因组分析来检测cfDNA中的异常[37]。该研究专注于cfDNA的片段大小,发现与非癌症cfDNA相比,癌症衍生的cfDNA片段长度的变化更大。利用机器学习模型,结合全基因组片段特征,可以将早期癌症检测灵敏度提高到99%,特异度达到98%。DELFI方法与基于突变的cfDNA分析结合使用时,其灵敏度可以达到91%,特异度为98%。这为利用cfDNA分析人类早期癌症筛查和监测提供了新的策略。液体活检ctDNA主要代表死亡肿瘤细胞的基因组,但癌症的进展和治疗过程中的耐药性却是由活的肿瘤细胞驱动,因此,选择合适的ctDNA筛选时间点至关重要。目前的研究指出,如果在肿瘤活检之前进行液体活检,ctDNA检测可能会消除组织活检的需要,但如果ctDNA分析为阴性,组织活检仍可能提供有价值的基因组信息[27]。

2.2.2ctDNA在胰腺癌其他方面的应用 (1)ctDNA与肿瘤预后。有研究表明,血浆中ctDNA水平与肿瘤大小和分期相关,较高水平的ctDNA可能是胰腺癌患者生存率较差的独立危险因素[15]。ctDNA可监测肿瘤复发,在进行手术或治疗后,即使在没有任何其他临床疾病证据的情况下,检测到ctDNA也可能表明存在最小残留病灶,故ctDNA的存在还可以识别可能具有较高复发风险的患者[27]。(2)ctDNA用于疗效评估。ctDNA可监测转移性胰腺癌的化疗应答,当治疗失败时,血浆中可检测到耐药胰腺癌细胞的DNA片段[38],且在一项关于总cfDNA水平的动态变化与化疗后的肿瘤负荷关系的研究中,提供了治疗前ctDNA水平与PDAC肿瘤负荷相关的证据,并且显示连续cfDNA分析是监测癌症对化疗反应的可靠工具[39]。

2.3细胞外囊泡 PDAC中细胞外囊泡水平的诊断和预后评估价值已在研究中得到证实。即使在早期PDAC患者血清中,PDAC衍生细胞外囊泡中富集的磷脂肌醇蛋白聚糖-1也有较高的灵敏度和特异度[18]。同样,细胞外囊泡中特征微小RNA的表达水平可用于PDAC的早期诊断[40]。

3 展 望

多维度评估基因组状态或将成为肿瘤早筛技术趋势。从上述研究不难看出,基于液体活检技术所衍生出来的早筛对象不只局限于循环DNA层面甲基化标志物,已有发展为多维度指标联合评估的趋势。虽然国内外已有部分研究肿瘤早筛的数据,但多为处于单一检测维度或体细胞突变联合甲基化分析的方法,且大多处于起步阶段,正在进行检测技术的优化、标本的累积或前瞻性临床试验的验证。胰腺癌早筛空间广阔,对于液体活检技术而言,其样本前处理、提取方法和检测灵敏度上还存在一些问题,当前最重要的是找到合适的目标分析物,提高早筛的灵敏度和特异度。为了进一步提升早期胰腺癌的检测能力,更好地筛选中国胰腺癌高危人群,目前部分研究正在纳入基因组拷贝数变异、cfDNA片段组学等分析,并且基于多维度生物标志物的大型胰腺癌早筛研究也陆续在开展中。随着众多学者对胰腺癌液体活检更深入的研究,液体活检正在得到越来越多的认可。此外,随着创新性检测技术的发展和检测成本的降低,今后液体活检有望普及,为胰腺癌的筛查和早期诊断提供更多的临床帮助。