吕 川，朱慧志，刘向国，曹晓梅，夏咏琪，张秋萍，余子奇

（1.安徽中医药大学第一临床医学院，安徽 合肥 230031；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031；3.安徽中医药大学，安徽 合肥 230031；4.安徽中医药大学中医学院，安徽 合肥 230012）

支气管哮喘（bronchial asthma，BA），简称哮喘，是常见的慢性肺系疾病之一，严重影响着患者的生活质量，给卫生健康领域带来了极大的负担［1］。哮喘的病理特征主要有气道炎症、气道重塑［2，3］。气道炎症是哮喘的本质，气道重塑则是本病发生、发展及恶化的主要原因，其特点是杯状细胞增生、胶原纤维沉积、平滑肌细胞增殖和黏液分泌增多［4］。研究发现，JAK2/STAT3 信号通路与哮喘气道重塑的发生密切相关［5］，IL-6 作为其上游因子，可以通过激活JAK2/STAT3 信号通路，进而参与其中。

西医治疗哮喘的选择较为局限，首选糖皮质激素，具有一定效果，但长期使用副作用较大，且无法逆转气道重塑过程。中医药治疗哮喘疗效显著，特色鲜明，且副作用小，存在巨大的临床运用潜力，其作用及相关机制值得进一步探索和挖掘。阳和平喘颗粒是国家级名老中医胡国俊教授在《椿田医话》阳和饮的基础上化裁，并在临床诊疗中总结，最终成方，多年来一直运用于哮喘的治疗上，疗效明显［6］。课题组前期动物研究表明，阳和平喘颗粒可以减轻气道上皮、杯状细胞，气道黏液等的分泌与增生［7-9］，进而缓解哮喘大鼠气道重塑。但其能否通过调控IL-6/JAK2/STAT3 信号轴来调节哮喘气道重塑的机制未深入研究，因此本研究旨在基于IL-6/JAK2/STAT3 信号轴探讨阳和平喘颗粒防治哮喘气道重塑的作用机制，为临床治疗提供进一步的理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性SPF 级SD 大鼠42 只，7～8 周龄，体质量230～250 g，浙江维通利华实验动物公司。大鼠饲养环境：明暗交替各12 h，室内平均温度（20±2）℃，湿度50%±5%，自由进食及饮水。所有操作已通过安徽中医药大学动物伦理委员会的批准（批号：AHUCM-rats-2019007）。

1.2 药物及试剂

药物组成：麻黄6 g、五味子6 g、熟地15 g、巴戟天10 g、旋覆花9 g、葶苈子10 g、桔梗10 g、白芥子6 g、当归10 g，购自安徽省中医院制剂中心，采用复方免煎颗粒的形式，10 g/包，每克含生药量2.7 g，生产批准号：21050059；卵清蛋白（北京绿生源生物公司，批号AP0028）。苏木素染液、PAS 染色试剂盒、Masson 三色染色液（Ebiogo 公司，批号分别为：05092312、06092310、05162314） ；IL-6、IL-23、IL-17A 试剂盒（武汉基因美公司，批号20230810）；JAK2 抗 体（bioss 公 司，批 号：AD19051026），P-JAK2、STAT3、P-STAT3 抗体（abcam 公司，批号分别为GR3215065-4、GR3105216-7、GR3380060-4）；Trizol（Life technogies 公 司，批 号：420810）；DEPC-H2O（Generay Biotech 公司，批号：JD721229）；反转录试剂盒（TaKaRa 公司，批号：AM62082A）。

1.3 仪器

超声雾化器（广东粤华医疗器械公司）；显微镜（OLYMPUS）；离心机（安徽嘉文仪器公司）；电泳仪、电泳槽（上海天能公司）；PCR 仪（Thermo Scientific）。

1.4 动物分组、造模及给药

SD 雄性大鼠42 只，适应性饲养7 d，按随机数字表法分为：正常对照组、模型组、阳和平喘低、中、高剂量组、地塞米松组，每组7 只。复制哮喘大鼠模型［10］，分为致敏2 周与激发4 周两个阶段。（1）致敏：除正常对照组外，其余各组在第0、7 天给予10%OVA+氢氧化铝混悬液腹腔注射，每只大鼠1 mL；（2）激发：自第14 天开始用1%OVA 进行雾化，每日一次，每次30 min，持续4 周。给药：每次雾化前半小时给药。根据人与大鼠体表面积法［11］，计算出阳和平喘低、中、高剂量分别为3.87、7.74、15.48 g/kg，按照10 mL/kg 进行灌胃给药。第14 天开始，阳和平喘低、中、高剂量组每日灌胃1 次，地塞米松组予以0.062 5 mg/kg 的地塞米松［12］每日灌胃1 次，持续4 周。大鼠出现明显的点头呼吸、呼吸急促、烦躁不安、毛色枯黄、体重减轻等呼吸道及全身症状则表明哮喘模型成功复制［13］。

1.5 HE、PAS、Masson染色观察肺组织病理学变化

取右肺，固定，制成切片，置于干燥箱60 ℃ 烤片30 min.切片脱蜡、下行乙醇入水。（1）HE 染色：常规染色、脱水、透明、封片，观察炎症细胞浸润程度、支气管管腔狭窄情况以及分泌物的变化状况并摄片。（2）PAS 染色：滴加Schiff 染液，孵育，流水清洗干净，苏木素复染切片，冲洗，脱水，二甲苯透明，封片后光镜观察大鼠肺组织杯状细胞增生情况并摄片。（3）Masson 染色：滴加Bouin 液，孵育，流水冲洗，天青石蓝、苏木素染色液滴染，苯胺蓝染色液复染，脱水封片，观察上皮下胶原纤维沉积情况。

1.6 ELISA检测大鼠血清中IL-6、IL-23、IL-17A水平

取腹主动脉血，收取上清液，检测IL-6、IL-23、IL-17A 水平。

1.7 Western blot 法检测大鼠肺组织中JAK-2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3 蛋白表达量

取右肺组织样本0.1 g，加入细胞裂解液进行裂解。离心15 min，收集上清液，蛋白浓度使用BCA法进行测量，缓冲液稀释后，沸水浴加热变性；上样，电泳；PDVF 膜转膜；完毕后封闭2 h；一抗孵育（JAK2、STAT3稀释比为1∶1 000，P-JAK2、P-STAT3稀 释 比 为1∶2 000）过 夜，PBST 洗 涤3 次；按1∶20 000 加 入 二 抗，孵 育1.2 h，PBST 洗 涤3 次，使用Image J 软件进行统计分析处理，得到目标蛋白的相对表达量。

1.8 qRT-PCR 检 测 大 鼠 肺 组 织 中IL-6、JAK2、STAT3 的mRNA 表 达 水 平

取右肺组织剪碎，研磨成粉状，采用Trizol 法提取总RNA，按照试剂盒说明书步骤将RNA 逆转录为cDNA，再进行PCR 扩增。引物由安徽中抗生物技术有限公司合成，β-actin（150 bp）引物序列：上游5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下 游5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′；IL-6（98 bp）引物序列：上游5′-GCCTTCTTGGGACTGATGTT-3′，下 游 5′-ACTGGTCTGTTGTGGGTGGT-3′；JAK2（182 bp）引 物 序 列：上 游5′-ATAGATGAGTCAACCAGGCA-3′，下 游5′-CCATGAACAAAATCATGCCG-3′；STAT3（115）引 物 序 列：上 游 5′-GCAATACCATTGACCTGCCG-3′，下游5′-AACGTGAGCGACTCAAACTG-3′。PCR 扩增的反应条件：95 ℃预变性1 min，60 ℃退火1 min， 72 ℃延伸30 s， 共进行40次循环，以β-actin 作为内参，采用2-△△Ct法计算大鼠肺 组 织IL-6、JAK2、STAT3 mRNA 相 对 表 达 量。2-△△Ct方 法 为：（1）计 算 实 验 组△Ct 值：△Ct实验=Ct目的－Ct内参；（2）计 算 对 照 组△Ct 值：△Ct对照=Ct目的－Ct内参；（3）计算相对表达量：△△Ct=△Ct实验－△Ct对照，相对表达量=2-△△Ct。

1.9 统计学处理

采用SPSS 26.0 对数据进行统计分析，计量资料以（±s）表示，用单因素方差分析来进行组间对比，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 阳和平喘颗粒对大鼠肺组织病理形态学的影响

正常对照组肺组织无明显异常，肺泡腔干净无分泌物渗出；与正常对照组比较，模型组肺组织炎症细胞浸润，杯状细胞增生，黏液分泌增多，上皮下胶原纤维沉积增加；与模型组比较，各给药组炎症细胞浸润程度和分泌物生成状况均有不同程度的改善，杯状细胞增生、黏液分泌以及上皮下胶原纤维沉积明显改善。见图1。

2.2 阳和平喘颗粒对大鼠血清中IL-6、IL-23、IL-17A 水平的影响

与正常对照组比较，模型组IL-6、IL-23、IL-17A水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，给药组IL-6、IL-23、IL-17A 水平显著降低（P＜0.01），其中阳和平喘高剂量组降低最为明显。见表1。

图1 阳和平喘颗粒对大鼠肺组织病理形态学的影响（50×）Fig 1 Effect of Yanghe Pingchuan Granules on pathological morphology of lung tissue from rats（50×）

表1 阳和平喘颗粒对大鼠血清IL-6、IL-23、IL-17A 水平的影响（n=7，±s）Tab 1 Effect of Yanghe Pingchuan Granules on levels of IL-6、IL-23、IL-17A in serum of rats（n=7，±s）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。

组别剂量(g/kg)正常对照组模型组阳和平喘低剂量组阳和平喘中剂量组阳和平喘高剂量组地塞米松组--3.87 7.74 15.48 6.25×10-5 IL-6(pg/mL)102.41±6.05 276.14±10.75**205.05±4.78##174.04±7.00##147.39±3.76##158.51±3.66##IL-23(pg/mL)92.83±10.96 463.70±15.93**404.92±4.19##304.94±7.89##250.09±5.83##267.76±14.56##IL-17A(pg/mL)153.50±11.98 427.90±8.42**374.58±7.44##325.03±10.33##261.00±6.83##286.55±9.43##640.70＜0.01 F P 498.08＜0.01 867.06＜0.01

2.3 阳和平喘颗粒对大鼠肺组织JAK-2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3 蛋白表达量的影响

与正常对照组比较，模型组JAK-2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3 表达量显著升高（P＜0.01）；与模 型组比较，各给药组JAK-2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3 表 达 量 显 著 下 降（P＜0.01）。 见 表2，图2。

2.4 阳和平喘颗粒对大鼠肺组织IL-6、JAK2、STAT3 mRNA 水平影响

与正常对照组比较，模型组IL-6、JAK2、STAT3 mRNA 的水平显著上升（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组IL-6、JAK2、STAT3 mRNA 的水平显著下降（P＜0.01），其中阳和平喘高剂量组与地塞米松组最为接近正常对照组。见表3。

图2 阳和平喘颗粒对大鼠肺组织JAK-2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3 蛋白表达量的影响Fig 2 Effect of Yanghe Pingchuan Granules on the protein expression of JAK-2、P-JAK2、STAT3 and P-STAT3 in lung tissue of rats

表2 阳和平喘颗粒对大鼠肺组织JAK-2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3 蛋白表达量的影响（n=7，±s）Tab 2 Effect of Yanghe Pingchuan Granules on the protein expression of JAK-2、P-JAK2、STAT3 and P-STAT3 in lung tissue of rats（n=7±s）

表2 阳和平喘颗粒对大鼠肺组织JAK-2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3 蛋白表达量的影响（n=7，±s）Tab 2 Effect of Yanghe Pingchuan Granules on the protein expression of JAK-2、P-JAK2、STAT3 and P-STAT3 in lung tissue of rats（n=7±s）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。

组别正常对照组模型组阳和平喘低剂量组阳和平喘中剂量组阳和平喘高剂量组地塞米松组P-STAT3 0.09±0.02 0.74±0.02**0.54±0.04##0.40±0.08##0.27±0.06##0.28±0.07##53.11＜0.01剂量(g/kg)--3.87 7.74 15.48 6.25×10-5 F P JAK2 0.14±0.03 0.87±0.04**0.69±0.05##0.56±0.06##0.46±0.04##0.43±0.05##84.29＜0.01 P-JAK2 0.12±0.02 0.82±0.06**0.61±0.06##0.53±0.04##0.38±0.05##0.36±0.07##67.20＜0.01 STAT3 0.20±0.02 0.94±0.07**0.73±0.05##0.60±0.04##0.46±0.03##0.43±0.05##88.68＜0.01

表3 阳和平喘颗粒对大鼠肺组织IL-6、JAK2、STAT3 mRNA 水平的影响（n=7，±s）Tab 3 Effect of Yanghe Pingchuan Granules on the mRNA expression of IL-6， JAK2 and STAT3 in lung tissue of rats（n=7±s）

表3 阳和平喘颗粒对大鼠肺组织IL-6、JAK2、STAT3 mRNA 水平的影响（n=7，±s）Tab 3 Effect of Yanghe Pingchuan Granules on the mRNA expression of IL-6， JAK2 and STAT3 in lung tissue of rats（n=7±s）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。

STAT3/2-△△Ct 1.00±0.05 1.75±0.06**1.41±0.02##1.32±0.06##1.18±0.03##1.15±0.05##193.41＜0.01组别正常对照组模型组阳和平喘低剂量组阳和平喘中剂量组阳和平喘高剂量组地塞米松组剂量(g/kg)--3.87 7.74 15.48 6.25×10-5 F P IL-6/2-△△Ct 1.00±0.53 2.80±0.43**1.67±0.05##1.43±0.05##1.19±0.06##1.13±0.06##77.84＜0.01 JAK2/2-△△Ct 1.01±0.12 7.24±0.85**3.76±0.32##2.96±0.16##1.61±0.30##1.60±0.29##181.70＜0.01

3 讨论

哮喘作为一种慢性呼吸道疾病，其机制主要包括气道炎症与气道重塑，二者关系密切。气道重塑主要由构成气道壁的细胞结构、组分和功能变化而引起的气道平滑肌细胞增殖及气道壁增厚［14］，被认为是哮喘病情反复的重要因素［15］。在哮喘的发生过程中，气道上皮组织中的炎症细胞持续释放多种细胞因子、趋化因子等致炎因子，促使上皮组织发生损伤-修复-再损伤-再修复过程［16］，最终导致的气道重塑是哮喘病发生发展的重要病理基础。

阳和平喘颗粒具有补肾、活血、化痰等功效。方中麻黄宣肺平喘、利水消肿，为开肺治感第一要药；旋覆花降气化痰平喘，葶苈子泻肺降气，祛痰平喘，二药相须为用，共助麻黄开宣肺气、祛痰平喘，又可降肺气以防肺气宣发太过；白芥子利气豁痰，桔梗理气祛痰，二药性浮，宣通肺气，使痰随气上下而解；巴戟天补肾阳，熟地黄滋阴血，二药共补肾阴肾阳，佐以五味子收敛固涩、补肾益气，三药温补肾之气血阴阳，增强肾摄纳肺气以达平喘的功用；当归调和气血，血和则能令气降，不致气血散乱而无所归。诸药合用，共奏温肾宣肺、化痰降气、活血调营的功效。本研究建立大鼠哮喘模型，并给予不同剂量的阳和平喘颗粒进行干预，大鼠体重、毛色、精神等整体状态明显好转，肺部炎症、杯状细胞增生、胶原纤维沉积明显减轻，提示阳和平喘颗粒可以改善哮喘模型大鼠肺部病理改变，减轻肺部损伤。

研 究 表 明［17，18］，IL-6/JAK2/STAT3 信 号 轴 的激活参与哮喘发生、发展的多个环节，抑制其激活可以缓解哮喘气道炎症、氧化应激水平以及气道重塑。在哮喘的发生过程中，IL-6 可与细胞表面的受体IL-6R 结合，以复合物的形式存在，复合物再与膜糖蛋gp130 相互结合形成新的复合物并诱导JAK2激酶磷酸化，进而促使其下游STAT3 的表达增加［19］，激活后的STAT3 进一步活化Th17 细胞分化关键核因子RORγt，促进Th17 分泌IL-17A 等炎症因子［20］。STAT 是哺乳动物体内多种细胞因子和生长因子的信号传导者，在调节免疫细胞内稳态、分化和细胞功能方面发挥着关键作用，且参与哮喘的发生［21，22］。STAT 是JAK 的下游靶点，其关键调控由磷酸化介导，通常由JAK2 完成［23］。气道平滑肌细胞增殖是气道重塑的典型特征之一，研究发现，JAK2 可通过上调miR-375 的表达，促进哮喘患者体内气道平滑肌细胞增殖并推动其迁移［24］。相关研究表明，STAT3 能够促进气道平滑肌增殖，抑制其表达可明显改善哮喘患者生活质量［25，26］。本研究结果显示，模型组IL-6、JAK2、STAT3 的表达水平明显上升，说明模型组大鼠在持续存在的气道炎症刺激下，气道重塑程度加重；与模型组相比，各给药组JAK2、STAT3 的表达均有 下降，IL-6 的表达同样下降，提示阳和平喘颗粒可能通过抑制IL-6，进而抑制JAK2/STAT3 信号通路的传导，从而降低气道平滑肌增殖，缓解气道重塑。

IL-6、IL-23、IL-17A 是各类炎症反应中常见的炎症因子，并且与哮喘气道重塑密切相关。IL-6 作为体内重要的促炎因子，能够决定适应性免疫的类型，调节CD4+T 细胞进而降低Th1 细胞的分化，同时IL-6 还能抑制Treg 细胞并推动Th17 分化，进而诱导哮喘气道重塑［27］。此外，对人类支气管组织样本的分析表明IL-6 参与哮喘期间的气道重塑［28］。IL-23 是由活化的树突状细胞、巨噬细胞及单核细胞等产生的炎症介质，能促进活化的Th17 细胞生长 和 增 殖，进 而 分 泌IL-17A 等 炎 症 介 质［29，30］。IL-17A 是IL-17 家族的主要成员，能够促进多种炎症细胞的聚集，进而推动炎症的发生［31］。当Th17/Treg 免疫失衡时，Th17 细胞作为黏膜动态平衡的守门员，能够通过分泌IL-17A，促进纤维细胞沉积，继而导致气道重塑［32］。本研究结果显示，模型组IL-6、IL-23、IL-17A 的表达水平显著升高，表明炎症反应是哮喘发生过程中的重要环节，给药后各组大鼠肺组织病理损伤减轻，IL-6、IL-23、IL-17A 的表达水平均有不同程度的降低，以阳和平喘高剂量组降低最为显著，表明阳和平喘颗粒通过抑制IL-6、IL-23、IL-17A 炎症因子的释放，缓解哮喘模型大鼠气道炎症，改善气道重塑。

综上所述，阳和平喘颗粒可能通过抑制IL-6/JAK2/STAT3 信号轴的激活，降低肺内炎症因子的表达，减轻杯状细胞生成和胶原纤维增生，抑制气道平滑肌增殖，最终达到改善哮喘气道重塑的目的。本课题组后续将应用相关通路抑制剂，进一步阐述此通路在阳和平喘颗粒改善哮喘中的具体机制。

作者贡献度说明：

吕川：文章的设计及撰写；吕川、夏咏琪、余子奇：动物实验实施、数据收集整理；曹晓梅、张秋萍：实验管理及数据分析；朱慧志、刘向国：文章的质量控制及修稿。

所有作者声明不存在利益冲突关系。