张雪花, 王卫华, 武 奇, 李 丁, 平继辉, 梅 梅

(1.江苏省农业科学院动物免疫工程研究所/国家兽用生物制品工程技术研究中心/江苏省食品质量与安全重点实验室,江苏 南京 210014; 2.兽用生物制品<泰州>国泰技术创新中心,江苏 泰州 225300; 3.南京农业大学动物医学院,江苏 南京 210095)

中国于1994年在广东分离出第一个H9N2病毒。中国提供的数据中(全球共享所有流感数据倡议,GISAID)H9N2分离株超过70%。最新的活禽市场监测结果显示,2014-2022年H9N2分离率持续居高不下,H9N2亚型逐渐超越其他亚型,成为家禽中最主要的亚型,同时也成为养禽业的头号感染源[1-2]。大多数感染H9N2 AIV(亚型禽流感)的鸡不会直接死亡,从而保留了二次感染其他亚型流感病毒的机会,促进了病毒重组。H9N2禽流感病毒作为“供体病毒”,为包括H3N8、H5N1、H7N9、H10N8和H10N3在内的各种病毒亚型提供多个内部基因[3-6]。H9N2 AIV继续传播和进化将进一步增加它作为新AIV基因供体的风险。尽管H9N2 AIV对禽类的致病性不强,但当与家禽中的其他病原体发生共感染或继发感染时,会造成重大经济损失[7-9]。

1998年,中国广东报道了世界首例人类感染H9N2禽流感病毒的病例[10]。截至2021年12月,在全球报告中,人类感染H9N2禽流感病毒确诊病例已达95例,其中2020-2021年报道的33例病例中有32例来自中国,证实了H9N2禽流感病毒存在宿主溢出的高风险[11]。可见H9N2不仅给家禽业造成严重的经济损失,也对人类健康构成重大的威胁,是重要的人兽共患病病毒。

H9型AIV与H5、H7型高致病性禽流感的控制策略不同。虽然没有强制接种H9N2禽流感疫苗,但几乎所有鸡群都接种了H9疫苗,以减少潜在的经济损失。中国兽药基本信息数据库数据表明,在过去5年中,全国大约有50家生物公司生产了单价或多价H9N2疫苗。经认证的H9疫苗相关产品中,疫苗株多达25株,且均为全病毒灭活疫苗。研究和临床数据表明,接种H9N2疫苗可以减少病毒感染引起的临床症状,为免疫鸡群提供有效保护。然而,H9N2频繁的抗原漂移是当前H9N2疫苗接种的挑战之一。当H9N2疫苗毒株与流行毒株之间的抗原性存在差异时,全病毒灭活疫苗无法提供足够的保护[12]。H9N2疫苗需要优化毒株以适应当前病毒变异、多抗原群共流行的情况。重要的是,H9N2灭活疫苗主要诱导体液免疫,难以阻断鸡上呼吸道的病毒感染和排毒。H9N2 AIV能够有效地在鸡与鸡之间进行气溶胶传播,即使在接种疫苗的鸡之间也是如此[13],加大了病毒防控难度。因此,“防排毒”成为H9N2新型疫苗研制的新标准和又一挑战。目前迫切需要开发更高效的疫苗来防控H9N2,例如在细胞和黏膜免疫水平上改进现有疫苗,或开发广谱疫苗以应对抗原的频繁变异[14]。

本研究室拟通过对H5亚型AIV的血凝素(HA)蛋白质序列进行比对分析,设计出HA共有序列,制备成HA亚单位疫苗,效力试验结果证明,HA亚单位疫苗对不同流行毒株具有理想的保护效果[15-16]。基于以上研究成果,本研究同样选择具有免疫原性的HA基因,通过对2010-2019年H9亚型AIV HA蛋白关键性氨基酸位点进行分析和统计,选择每个位点最高频率氨基酸序列,并对关键性抗原位点进行校正,设计出HA(H9亚型)共有序列[16],利用杆状病毒表达系统表达HA蛋白。免疫效力试验结果表明,该疫苗具有良好的、广谱的免疫效果,为后续广谱疫苗的研究提供了研究数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本实验室于2017-2019年在浙江、安徽、江苏和山东等省份的养鸡场分离筛选H9亚型AIV毒株 115、236、YZ,经进化树分析,3个毒株属于h9.4.2.5分支的不同亚分支。H9亚型禽流感代表性毒株[A/chicken/Shandong/6/1996 (h9.4.2.3)(SD/6)、A/chicken/Guangxi/55/2005 (h9.4.2.5)(GX/55)、A/turkey/Wisconson/1/1966 (h9.1)(WI/1)]由南京农业大学平继辉教授惠赠。杆状病毒表达系统为本实验室保存。

1.2 试验方法

1.2.1 目的基因的设计 对2010-2019年公布的H9亚型AIV HA蛋白的抗原相关位点、受体结合位点、潜在糖基化位点等关键序列进行分析,结合本试验室分离的H9流行株关键性氨基酸位点,利用生物信息学软件选择高频氨基酸,并对关键性位点进行校正,设计合成基因HA。

1.2.2 重组杆状病毒的获得与鉴定 利用杆状病毒表达系统构建和制备含有目的基因HA的重组杆状病毒,经蓝白斑筛选获得含有HA基因的重组质粒。用HA重组质粒转染Sf9细胞,27 ℃静置培养,每天观察,待转染细胞出现停止生长、变圆、脱落等细胞病变症状时,收获,得到重组杆状病毒rVHA。提取rVHA基因组DNA,然后进行PCR鉴定。PCR鉴定正确后,取重组病毒rVHA上清液接种Sf9细胞,观察4 d,固定细胞,进行间接免疫荧光鉴定重组病毒特异性。

1.2.3 重组蛋白的表达、分析 取重组杆状病毒rVHA上清液,接种悬浮培养的high five细胞,同时将野生型杆状病毒感染high five细胞作为对照。每天取少量细胞液进行台盼蓝染色,观察细胞死亡情况,待细胞90%变蓝后收获,利用高压均质机将细胞破碎,进行Western-Blot、血凝活性等分析。

1.2.4 红细胞凝集试验检测重组蛋白HA血凝活性 在微量血凝板上先加25 μl 磷酸缓冲盐溶液(PBS);第一孔加25 μl重组蛋白(rHA)混匀,倍比稀释至216;每孔再加入25 μl PBS、25 μl 1%鸡红细胞悬液,室温(20～25 ℃)下反应30 min,记录结果。

1.2.5 重组杆状病毒传代后遗传稳定性及增殖性能鉴定 将重组杆状病毒rVHA连续传代至第8代,对每代HA基因的核酸序列进行测序。对每代重组杆状病毒进行病毒滴度(TCID50)鉴定,评价重组杆状病毒的增殖性能。

1.2.6 交叉血凝抑制试验(HI) 检测rHA与不同分支H9亚型AIV病毒阳性血清(115、236、YZ、SD/6、WI/1)的交叉反应活性,设无特定病原(SPF)阴性血清为对照。

1.2.7 重组蛋白的免疫原性评价 重组蛋白rHA与白油按体积比1∶3乳化制备成HA油乳剂疫苗。乳化完全后,经性状、稳定性和无菌检验后,无菌装入疫苗瓶内,命名为rHA疫苗,4 ℃保存。

10日龄SPF鸡30只,分3组,每组10只鸡。第一组,rHA疫苗组,颈部皮下注射rHA疫苗,每只注射0.5 ml;第二组,商品疫苗组,每只注射0.3 ml;第三组,阴性对照组,每只注射0.5 ml无菌生理盐水。免疫后第14 d、21 d、28 d 采血,分离血清,检测血清HI抗体效价。免疫28 d后,选取2株处于不同亚分支的H9亚型AIV流行毒株115和YZ株进行攻毒,每只攻毒剂量为1×106.0EID50(半数鸡胚感染量)。每日观察鸡群采食量、饮水量以及精神状态是否出现异常,观察是否出现发病和死亡情况。攻毒后2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d称量各组试验鸡的质量,计算鸡的相对增质量率。攻毒后3 d、5 d、7 d用无菌棉拭子采集鸡喉头和泄殖腔分泌物,采集的拭子样品通过尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚3枚,每枚 0.2 ml,每天观察,连续观察5日,检测鸡胚尿囊液血凝效价。若接种喉拭子或泄殖腔拭子的鸡胚任何一个出现鸡胚尿囊液血凝效价≥1×22,则该鸡排毒;若鸡胚尿囊液血凝效价<1×22则为可疑,需要盲传一代,盲传后血凝效价<1×22则判定为阴性,表明该鸡不排毒。

1.3 数据处理

用Reed-Muench法计算病毒滴度。用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 重组质粒的鉴定

对构建的pFastBac1-HA重组杆状病毒转移质粒进行双酶切验证,获得目的基因和载体2个条带(图1),结果表明HA基因与载体pFastBac1连接成功。

M:DL5 000 marker;1:双酶切重组质粒。图1 重组质粒pFastBac1-HA的鉴定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid pFastBac1-HA

2.2 重组病毒的拯救与鉴定

用重组质粒转染Sf9细胞,细胞变大变圆,折光率增加,细胞停止生长,表明细胞出现病变,收获为rVHA。通过间接免疫荧光检测重组病毒rVHA感染的细胞与不同H9阳性血清反应的情况,荧光显微镜下可见,感染重组病毒的细胞出现明亮的绿色荧光(图2A～图2C);野生型杆状病毒感染细胞未出现明显荧光(图2D),表明含HA基因的重组杆状病毒拯救成功,且表达的HA蛋白与不同H9阳性血清间有反应活性。

2.3 Western blot鉴定重组蛋白的表达

rVHA感染的high five细胞完全病变后收获,用高压均质机裂解细胞,然后进行Western-Blot鉴定,rHA与H9亚型AIV阳性血清孵育后,出现与预期大小一致、较明显的特异条带63 000(图3),证明HA蛋白成功获得大量表达。

A:rVHA感染Sf9细胞(115血清);B:rVHA感染Sf9细胞(SD/6血清);C:rVHA感染Sf9细胞(WI/1);D:野毒感染Sf9细胞(115血清)。图2 重组蛋白HA与不同H9亚型禽流感阳性血清结合的间接免疫荧光法鉴定Fig.2 Indirect immunofluorescence assay identification of recombinant protein HA reacting with positive sera of different H9 avian influenza subtypes

M:蛋白marker;1:重组蛋白HA;2:野生杆状病毒对照。图3 Western blot 分析重组蛋白质与H9阳性血清的反应Fig.3 Reaction of recombinant protein with positive sera of H9 subtypes avian influenza by Western blot

2.4 重组蛋白HA血凝活性

通过微量血凝试验检测rHA血凝活性,同时设115病毒尿囊液为对照,表达的重组蛋白HA血凝效价为1×212(图4),说明rHA具有凝集红细胞的生物学活性。

2.5 重组病毒遗传稳定性及增殖性能鉴定

测序结果显示,第1～8代重组杆状病毒的外源HA基因与目的序列完全一致,表明重组病毒具有良好的遗传稳定性。重组杆状病毒传至第7～8代时病毒滴度达108.00TCID50/ml以上(表1),表明重组杆状病毒增殖性能良好。

图4 重组HA蛋白的血凝活性检测Fig.4 Detection of hemagglutination activity of recombinant HA protein

表1 重组杆状病毒稳定性检测结果

2.6 重组HA蛋白交叉反应活性

通过HI试验测定rHA与不同分支H9阳性血清交叉反应的抗原性,并同时与不同分支H9病毒进行比较。由图5可知,rHA与现有流行毒株血清(h9.4.2.5)反应的HI滴度较高,与分支较远的WI/1(h9.1)反应最差。除去血清与同源病毒的反应,rHA反应活性明显优于其他病毒,表明rHA具有良好的交叉反应活性。

2.7 重组病毒的免疫原性评价

HI血清抗体作为流感疫苗血清学保护的反应指标,商品疫苗效力评判标准为HI抗体效价≥1×26.00。试验组于免疫后14 d、21 d、28 d采集静脉血,以分离的流行毒株115、YZ作为检测抗原检测血清抗体HI效价。重组蛋白疫苗免疫后14 d即可诱导鸡产生较高水平的 HI 抗体应答,免疫后14 d HI效价能达到1×212.00以上,免疫后28 d 达到1×214.59,rHA组抗体效价显著高于商品苗组(图 6)。

SPF鸡免疫28 d后,对不同亚分支的H9亚型AIV流行株115和YZ以1×106EID50的病毒量进行攻毒。临床观察结果显示,各攻毒试验组在攻毒后14 d内均无死亡。rHA组、商品苗组在攻毒后无异常,饮水量、采食量、精神状态均正常,空白组(阴性组)在攻毒后4 d食欲与饮水欲相对较差。

攻毒后2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d分别对各组试验鸡称体质量,并计算不同试验组鸡体质量相对增长率。结果显示,rHA免疫组的试验鸡相对增质量率最高;空白组(阴性组)的鸡相对增质量率明显低于免疫组(图7)。

a:rHA;b:h9.4.2.5-115;c:h9.4.2.5-236;d:h9.4.2.5-YZ;e:Sh9.4.2.3-SD/6;f:h9.1-WI/1。h9.4.2.5为流行毒株。图5 重组蛋白HA与H9不同阳性血清型交叉反应活性Fig.5 Cross-reactivity of recombinant protein HA with different positive serotypes of H9

A:以病毒115为检测抗原检测免疫后血清HI抗体;B:以病毒YZ为检测抗原检测免疫后血清HI抗体。*表示差异显著(P<0.05)。图6 不同抗原检测免疫后血清HI抗体Fig.6 HI antibody in sera after immunization detected with different antigens

A:感染115毒株后试验鸡相对增质量率;B:感染YZ毒株后试验鸡相对增质量率。图7 攻毒后不同试验组鸡的相对增质量率Fig.7 Relative weight gain rate of chickens in different experimental groups after challenge

115和YZ毒株感染后3 d、5 d、7 d分别采集各组试验鸡的咽拭子和泄殖腔拭子样品,测定攻毒后每只鸡的排毒情况。

感染115毒株3 d后,rHA疫苗组喉头排毒率为20%,泄殖腔排毒率为0;感染5 d后,喉头排毒率为20%,泄殖腔排毒率为0;商品苗感染3 d后,喉头排毒率为100%,泄殖腔排毒率为20%;感染5 d后,喉头排毒率为20%,泄殖腔未检测到排毒;阴性对照组感染3 d、5 d后,喉头排毒率为100%,泄殖腔排毒率为100%;感染7 d后所有组未测到排毒(表2)。

表2 感染115毒株免疫保护结果

攻击YZ毒株3 d后,rHA疫苗组的喉头排毒率为20%;其余未检测到病毒,排毒率为0。商品苗组攻毒3 d后的喉头排毒率为100%,泄殖腔排毒率为20%;攻毒5 d后喉头排毒率为40%,泄殖腔未检测到排毒。阴性对照组攻毒3 d、5 d后的喉头排毒率为100%,泄殖腔排毒率也为100%。7 d后所有组未测到排毒(表3)。

综上,rHA疫苗组保护率明显高于商品苗组,表明rHA疫苗对当前H9亚型AIV流行株毒株具有良好的保护效果。

表3 感染YZ毒株免疫保护结果

3 讨 论

目前,中国控制H9N2禽流感的主要策略是疫苗接种。然而,中国H9N2病毒多种抗原型同时流行,疫苗更新速度落后于病毒变异速度,使有效疫苗接种面临挑战。灭活疫苗免疫可有效减轻H9N2病毒感染后的临床症状,大大减少经济损失。然而,另一个挑战是全病毒灭活疫苗免疫不能阻止H9N2 AIV再感染或病毒脱落。在中国,包括散养和混养在内的传统畜牧业系统继续占据重要地位,然而,中国家禽业的主要发展方向是集约化圈养。研制具有广谱性中和活性的通用疫苗对于控制H9N2具有重要意义。关于广谱疫苗的研究已有报道,利用Epigraph算法来设计猪 H3 流感疫苗血凝素蛋白,该疫苗接种小鼠后可产生显著针对不同H3分离株的交叉反应抗体和T细胞反应,免疫雪貂后,用2种H3N2病毒攻击,该疫苗可保护雪貂免受攻击毒株的侵害[17-18];基于马赛克HA序列的H9亚型禽流感灭活疫苗能对异源H9N2 AIV株产生较好的交叉攻毒保护效果[19]。

随着基因工程技术的发展,重组病毒表达系统成为生产有广谱交叉免疫效果的禽流感疫苗的技术平台。杆状病毒表达系统具有诸多优点:不使用活病毒,生物安全性高;表达的HA蛋白可组装成病毒样颗粒(VLP),其结构功能与天然蛋白质相似,免疫原性良好,蛋白质表达效率高;重组杆状病毒基因遗传稳定,病毒增殖性能良好,保证了疫苗的生产质量[20-21]。

新型广谱疫苗一直是防控禽流感病毒相关研究的热点方向,只研究单个毒株的HA免疫原性,不能得到具有广谱保护效果的疫苗,本研究通过对2010-2019年H9亚型禽流感及本试验室分离的最新流行株 HA蛋白的抗原相关位点、受体结合位点、潜在糖基化位点等关键位点序列进行分析,并对关键位点进行校正,利用生物信息学软件选择每个位点最高频次氨基酸设计合成HA基因,并构建杆状病毒表达系统获得重组蛋白,经间接免疫荧光、免疫印迹、交叉血凝抑制试验对其广谱活性进行鉴定,初步证明重组蛋白具有广谱的交叉反应活性。

重组蛋白疫苗免疫后14 d即可诱导鸡产生较高水平的 HI 抗体应答,14 d HI效价能达到212.00以上,28 d达到1×214.59,显著高于商品苗组。用2株不同亚分支的H9亚型AIV毒株115、YZ攻击免疫组鸡,各组均未出现临床症状。攻击115毒株3 d后,rHA疫苗组保护率为80%,商品苗保护率为0;5 d后,rHA疫苗组保护率为80%,商品苗保护率为80%。攻击YZ毒株3 d后,rHA疫苗组保护率为80%,商品苗保护率为0;5 d后,rHA疫苗组保护率为100%,商品苗保护率为60%。表明,重组蛋白疫苗组产生较好的交叉保护效果,明显高于商品苗组。

另外,本研究采用高表达效率的high five细胞,提高了蛋白质的表达量,血凝活性高达1×212;high five细胞为无血清培养基培养的全悬浮细胞,降低了成本,生产周期变短,适于大规模培养,为亚单位疫苗规模化生产提供了可行性。

综上,通过分析、设计H9亚型禽流感HA关键位点等得到HA基因,利用Bac-to-Bac 表达的外源蛋白HA具有广谱的保护效力,可为研究 H9亚型广谱亚单位疫苗提供技术基础和科学依据。