李少英 何健淳 赵耿烨 冼嘉嘉 黄玲玲 何文智 马晓燕 张慧敏 张敏聪 黎青

广州医科大学附属第三医院妇产科，广东省产科重大疾病重点实验室，妇研所实验部 （广州 510150）

脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）是由于运动神经元存活基因1（survival mo⁃tor neuron gene 1，SMN1）突变导致SMN 蛋白功能缺陷所致的遗传性神经肌肉病，为常染色体隐性遗传［1-3］。发病率为1/10 000 ～ 1/6 000，携带率为1/85 ～ 1/35［4-7］。

SMN基因（survival motor neuron）位于染色体5q11.2 ～ q13.3 上，全长约为27 kb，含有9 个外显子，人基因组有两个紧邻的高度同源的SMN 基因，为SMN1基因（survival motor neuron gene 1，运动神经元存活基因1）与SMN2基因（survival motor neu⁃ron gene 2，运动神经元存活基因2），SMN1是主要功能基因，该基因突变可导致SMA 发病［8-9］，SMN2为临床表型的调节基因，影响病情的严重程度，其拷贝数增加可减轻SMA 表型［10-12］。临床上，SMA诊断以分子遗传学检测为基础。当患者因典型临床症状被怀疑为SMA 时，应当首先考虑进行基因检测，基因检测结果明确的无须再进行肌活检。约95%的SMA 患者由SMN1基因外显子7、8 纯合缺失导致，或只存在外显子7 纯合缺失。大多数患者的缺失遗传自父母，有2%的患者SMN1两个等位基因中的一个出现了新发缺失。有3% ～ 4%的病例，SMN1一个等位基因缺失，而另一个则出现了其他类型的突变［2-3］。目前已报道的检测技术众多，如SMN基因拷贝数检测常见的方法有PCR 结合限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法、定量聚合酶链反应法（qPCR）、二代测序法（NGS）及多重连接探针扩增法（MLPA）［13-22］；点突变技术有二代和三代测序［19-20，23-24］；而SMN1基因2+0 型变异目前仍没有直接检测方法。间接方法有：采用三代测序平台通过单倍型分析，推测受试者是否为2+0 型携带，因其研究的样本数量相对较少，从单倍型分析中得结果仍有待进一步研究［23-24］；采用滴式数字PCR 平台，通过单精子检测SMN1基因拷贝数，推算受试者是否为2+0 型携带，该方法只适用于男性受试者［25］。目前已报道的众多的检测技术均存在一定的局限性。由于SMN基因结构的复杂性，且约95%为缺失型变异基因致病特点，SMN基因拷贝数检测已成为SMA 检测的首选方法。SMN基因拷贝数检测常见的方法性能有所差异。其中，MLPA 技术目前被认为是定量SMN1和SMN2拷贝数的金标准方法［21-22］。但MLPA 因试剂非国产化，其耗材贵、操作步骤较复杂和检测时间长等缺点限制其在临床中的应用。然而，以上的其他方法对于检测SMN1和SMN2从0 ～ 4 的拷贝数均存在一定局限性［13-21］。

以荧光PCR-毛细管电泳（PCR/CE）为基础的SMN1和SMN2基因检测技术，比MLPA 技术快速、简便，且为国产化试剂。在本研究中，我们同时采用PCR/CE 技术和MLPA 技术，对337 个样本的SMN1和SMN2拷贝数进行检测，比较其方法的性能。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择自2010-2022年，就诊于本院生殖医学中心和产前诊断中心的患者共337 例，其中115 例为SMA 患儿或有SMA 家族史的患者，222 例为接受SMN1基因筛查的患者，所有研究对象均签署了知情同意书，授权医院在去掉所有个人信息后，检测数据可供研究参考。本研究通过广州医科大学附属第三医院伦理委员会批准，伦理批号：医伦专审［2021］第254 号。

1.2 方法

1.2.1 一致性分析 应用PCR/CE 方法与MLPA 法对同一样本在各自检测流程上进行平行测定，对两者检测结果进行一致性分析，在试验操作过程中及判定结果时采用盲法，并将结果填入病例报告表中，用于统计分析。检测结果以MLPA 方法检测结果为最终检测结果。

1.2.2 DNA 的提取 采用QIAmp DNA mini kit（QIAGEN，德国）快速DNA 提取试剂盒提取DNA样本。

1.2.3 MLPA法 采用SALSA probe mix P021（MRC Holland）［2-4］，经变性、杂交、连接反应、PCR 反应和ABI 3500 遗传分析仪毛细管电泳分析产物，试验检测过程中各检测方法的参数设定、检测及结果判定均严格遵循相应的说明书或操作说明。

1.2.4 PCR/CE 方法 人类SMN1和SMN2基因检测试剂盒（荧光PCR-毛细管电泳法）（厦门百欧迅生物科技有限公司），经PCR 反应和ABI 3500 遗传分析仪毛细管电泳分析产物，试验检测过程中各检测方法的参数设定、检测及结果判定均严格遵循相应的说明书或操作说明。

1.3 统计学方法 采用4 × 4 交叉表用SPSS（19.0版）软件分别统计SMN1 和SMN2 基因0、1、2、3、≥ 4检测结果。

2 结果

共检测337例样本，1例因MLPA法检测结果无法按照说明书判读剔除，经PCR/CE 方法与MLPA法检测并有完整的检测结果的样本共336 例，其中纯合缺失型（患者）50 例（14.9 %），杂合缺失型（携带者）65 例（19.3%），无缺失型221 例（65.8%）。荧光PCR-毛细管电泳法试剂检出SMN1和SMN2基因拷贝数为0、1、2、3、≥ 4 的结果与MLPA 方法检测结果完全一致。见表1。336 例样本采用4×4 交叉表用SPSS 软件分别统计SMN1和SMN2基因0、1、2、3 ≥ 4 检测结果，Kappa：1，总符合率：100%，见表2-5。

表1 PCR/CE 法与MLPA 法检测各不同样本类型结果汇总表Tab.1 Summary of results for different sample types Detected by PCR/CE and MLPA

表2 SMN1 基因外显子7 检测结果统计分析Tab.2 Statistical analysis of SMN1 gene exon 7 detection results

表3 SMN1 基因外显子8 检测结果统计分析Tab.3 Statistical analysis of SMN1 gene exon 8 detection results

表4 SMN2 基因外显子7 检测结果统计分析Tab.4 Statistical analysis of SMN2 gene exon 7 detection results

表5 SMN2 基因外显子8 检测结果统计分析Tab.5 Statistical analysis of SMN2 gene exon 8 detection results

3 讨论

SMA 基因诊断的结果应用于区分患者、携带者及正常人，对患者进行临床分型及病情评估，解释疾病的发生发展，开展药物治疗、多学科管理和定期随访，以延长患者生存周期、提高运动功能、延缓和减轻并发症的发生发展［10］。同时，为患者及家庭提供遗传咨询，包括遗传病因、传递模式、再发风险评估、产前诊断或植入前遗传学检测等再生育选择以及家庭成员携带者筛查建议等相关信息和指导。

SMA 基因诊断原则建议同时报告SMN1和SMN2的拷贝数，且拷贝数分析包括SMN1和SMN2的外显子7 和8［10］。由于基因结构的复杂性，且约95%为缺失型变异基因致病特点，SMN基因拷贝数检测为已成为SMA 检测的首选方法。

PCR-RFLP 方法有酶切不彻底的隐患，在临床上只能诊断SMN1纯合缺失的患者，不能检测SMN拷贝数。qPCR技术现已成为分子诊断领域的重要技术，其操作简单、快速经济、灵敏度高、高通量等优势，在SMN基因拷贝数检测中愈加受到重视［14］。其根据采用不同的荧光技术分为两类：TaqMan 系统和SYBR Green 系统。但因设备型号差异而无统一的操作技术标准，所以qPCR 在临床应用的稳定性还有待提高［14-15］。NGS 技术，相对于一代测序技术，有着更高数量级的测序通量，所以也称之为高通量测序，多应用于SMA 与其他表型易混淆的肌肉疾病初筛，另外在SMN2拷贝数分析方面，NGS还有待更多的证据证明其准确性和可靠性。已有大量的研究数据表明NGS 可以直接计算SMN1拷贝数，但筛查或诊断SMN1微小变异仍存在很大困难，目前在我国，NGS 尚未成为SMA 的常规检测方法。MLPA 技术是一种高效、特异的基因检测技术，其包含SMN区域和其他染色体上的许多对照探针，可以用于SMN 基因的总拷贝数参考或系统质量控制，因此，用MLPA 分析SMN 基因拷贝数比其他方法更准确、更有效，该技术除明确区分患者、携带者及正常人，同时检测患者的SMN2拷贝数，是目前临床上SMA 基因检测金标准［21-22］。但MLPA 因试剂非国产化，其耗材贵、操作步骤较复杂和检测时间长等缺点限制其在临床中的应用。

PCR/CE法适用于人样本中SMN1基因和SMN2基因第7 号外显子和第8 号外显子拷贝数（0、1、2、3、≥ 4）的检测，用于SMA 的辅助诊断。与目前临床上SMA 诊断金标准MLPA 技术比较。本次试验336 例样本中，SMN1基因外显子7 拷贝数分布0、1、2、3 的样本分别为50 例、65 例、211 例、10 例；本中心50 例纯合缺失型均为患者，65 例杂合缺失型受试者均为携带者，无复合杂合突变型患者，无缺失型221 例，SMN1基因阳性样本占全部研究样本的34.2%；SMN2基因外显子7拷贝数检测的准确性在全部人群中进行考察，0、1、2、3、≥ 4 的样本分别为6 例、78 例、197 例、56 例、9 例；在荧光PCR/CE法试剂检测范围内，其检测结果与MLPA 方法检测结果完全一致。TAN 等［17］评价了qPCR、滴式数字PCR、高分辨率熔融分析、PCR/CE 法和MLPA 五种方法在SMA 筛查中的检测性能，其得出的结论是以上方法中PCR/CE 法是最可靠的方法，在定量SMN1和SMN2的拷贝数方面与MLPA 具有良好的一致性，与我们本次研究的结果相符。方玉琴等［18］报道了CE 法在单基因病携带者筛查应用中是一种经济有效的方法。

综上所述，本研究PCR/CE 法试剂产品设计与目前临床上SMA 基因拷贝数检测的金标准方法MLPA 完全一致，可同时检测SMN1和SMN2基因外显子7 和8，且可相对定量至4 拷贝，结果可靠并可获得完整的基因信息，本次研究纳入的336 例合格样本检测结果表明，PCR/CE 法试剂检测SMN1和SMN2各基因不同拷贝数检测结果总符合率均为100%，且具有简便、快速等优点。适用于SMA 缺失型患者的辅助诊断和1+0 型携带者检测，其检出率约95%。但该方法存在一定局限性，其不能检出SMN1基因内点突变以及2+0 型携带者。未来需要研究开发可以检测单核苷酸变化的PCR/CE 法，以更适用于适用于SMA 辅助诊断和携带者检测。

【Author contributions】LI Shaoying performed the experiments and wrote the article.HE Jianchun，ZHAO Gengye，XIAN Jiajia，HUANG Lingling，ZHANG Huimin and ZHANG Mincong performed the ex⁃periments.HE Wenzhi and MA Xiaoyan revised the article.LI Qing designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.