柏小辉 蒋 丽 吴 震 陶 琦 潘萌莎

结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）目前已成为一种普遍的恶性肿瘤，全球发病率不断上升，CRC的发展过程具有多阶段、多步骤的特点[1]，早期CRC可通过手术方法治疗，发展到中晚期后则需依赖于化疗、放疗提高其五年生存率。虽然靶向药物在治疗CRC方面有优势，但对于自然或获得性耐药，其生存效益并不十分理想。根据《金匮要略》阐述及临床经验，大黄蛰虫丸（DHZCP）主要用于治疗因五劳七伤而致淤血阻滞，临床以体形消瘦、两目黯黑、肌肤甲错、腹满不食为特征。组方由熟大黄、蛰虫（炒）、水蛭（制）、虻虫（去翅足，炒）、蛴螬（炒）、桃仁、干漆（煅）、黄芩、白芍、炒苦杏仁、地黄和甘草12 味中药组成，具有“扫毒攻坚，荡涤积垢，推陈出新，虫动其疲，通以去闭，活血化疲。”之功效。对于CRC中后期出现的腹痛、消瘦、贫血、乏力、肠梗阻等症状有较好的针对性[2]。

网络药理学为目前中药学科的前端研究，通过揭示疾病、靶蛋白与药效组分之间的内在联系，在分子层面探索药效组分的作用机制，这与具有多组分、多途径、多靶点特性的中药复方拥有天然的兼容性，从而为中医向循证医学转变提供了新思路[3]。DHZCP治疗CRC确有疗效，但其药效物质基础致使其临床应用受限。本文拟通过网络药理学方法，探寻DHZCP所含化学组分与CRC相关靶点的结合效应，进而从系统生物学整体水平阐释其药效物质基础与作用机制，为DHZCP应用于CRC临床提供依据。

1 材料与方法

1.1 DHZCP化学组分数据库的构建 使用传统中药系统药理学数据库TCMSP和中国中药整合数据库TCMID收集DHZCP中每味中药的所有化学组分，并结合文献进行数据整理。

1.2 有效化学成分的筛选 本研究的建构模型为ADME（药物吸收、分布、代谢、排泄）模型，借助TCMSP平台系统来获取化学组分的口服利用度（OB）和类药性（DL）信息，筛选条件为OB≥30%及DL≥0.18，以此获得活性组分的作用靶点。运用UniProt数据库统一检索蛋白靶点ID及基因名。

1.3 DHZCP抗CRC核心靶点确定 基于DrugBank及联合化疗方案[4]，确定包括5-Fu、左旋亚叶酸、替吡嘧啶、瑞格菲尼、卡培他滨、伊立替康、曲氟尿苷、雷替曲塞、紫杉醇在内的CRC化疗药物9个，通过PharmMapperServer数据库预测其作用靶点。基于GeneCards数据库验证阳性药预测靶点与CRC的关系。将上述阳性药与DHZCP组分导入SwissTargetPredicton与PharmMapper数据库搜索作用靶点，合并去重后获得阳性药作用靶点和DHZCP组分的作用靶点。此外，在CTD数据库、GeneCards数据库中，以关键词“Colorectal Cancer”进行搜索。

1.4 网络模型拓扑学参数分析 使用NetworkAnalyzer插件计算网络模型拓扑学参数，靶点蛋白作为网络节点，度中心度（DC）、接近中心度（CC）、中介中心度（BC）作为与靶点蛋白相关联的主要参数值。综合前人研究经验[5]和特点，用“目标重要性（TI）”来定义主要目标评价指标。其中，TI值与模块中的关键目标成正比关系，即TI值越大则表明模块中拥有越多的关键目标。

1.5 KEGG通路富集分析 使用在线分析工具DAVID[6]软件针对上述26 个重要靶点进行KEGG通路注释分析，设定阈值P＜0.05。再通过Omicshare云平台系统对以上数据开展可视化处理。

2 结 果

2.1 活性组分的筛选 通过TCMSP、TCMID并结合文献挖掘收集大黄蛰虫丸中所含化学组分，以OB≥30%及DL≥0.18为条件对化学组分进行筛选，确定大黄蛰虫丸活性组分共226个，其中大黄19个、动物药25个、桃仁26个、干漆0个、黄芩40个、白芍19个、苦杏仁19个、地黄5 个、甘草99 个，包含14 个共有化学组分。

2.2 核心靶点确定 将阳性药预测靶点374 个（匹配度≥3）、DHZCP作用靶点282 个、CRC疾病相关靶点630 个取交集，获得DHZCP治疗CRC核心靶点34 个（见图1）。这些靶点不仅与CRC疾病密切相关，同时是CRC常用化疗药物与DHZCP的共同作用靶点。

图1 大黄蛰虫丸、阳性药与结直肠癌疾病相关基因交集靶点韦恩图

2.3 关键药效组分及主要靶点的网络特性 借助系统NetworkAnalyzer插件进行计算网络模型的拓扑学参数，通过网络节点的中心度值、网络度及亲中心度值可以获得各节点的TI值。分析数据筛选出7 个T≥0.2 的关键药效组分，依次为槲皮素、山奈酚、L-尿苷、白桦脂酸、汉黄芩素、异鼠李素、1-甲氧基菜豆素（见表1）。所筛选的关键组分不仅作用于更多的靶点，而且与众多靶点之间的最短路径的个数、接近程度均居于网络前列。进一步筛选出包含NOS2、PPARG、PIK3CG、F2、GSK3B、CDK2、PGR、CHEK1 等在内的出26 个主要靶点（见表2），其TI值均大于或等于0.11。

表1 7个关键药效组分的网络特性

表2 26个主要靶点的网络特性

2.4 PPI网络分析和关键靶点的筛选 把以上26 个重要靶点上传至STRING平台系统，得到PPI网络图（见图2）。PPI网络图涵盖节点数26 个和136 条互作边，0.755 作为平均节点度值。将“节点-节点”依据综合评分进行排序，排名靠前的分别为AKT1-NOS3，AKT1-GSK3B，CCNA2-CDK2，CASP3-MAPK14，NOS3-KDR，STAT1-MAPK14，AKT1-PIK3CG等。

图2 大黄蛰虫丸的26个共有靶点网络关系图

2.5 靶点生物功能及靶点-通路分析 将26 个重要靶点进行KEGG富集分析（P＜0.05），结果显示涉及的相关信号通路共111 条。其中，共同靶点主要富集的关键通路为PI3K-Akt、TNF、VEGF、HIF-、FoxO、Apelin、MAPK信号通路等。

3 讨 论

CRC常引起消化道出血、穿孔等并发症，治疗和预后效果不佳，复发和病死率较高。DHZCP出自《金匮要略》，是治疗“五劳极虚[7]，赢瘦腹满，不能饮食”的著名方剂。临床以DHZCP用于CRC术后辅助治疗，具有较好的效果。

本研究通过筛选中药方剂DHZCP的有效化学组分并对其拓扑学参数进行分析，得到几种重要组分。其槲皮素重要性排名最高（TI=0.44），研究显示，槲皮素细胞增殖、促凋亡、抑制肿瘤血管生成和抗CRC细胞转移的作用[8]。动物药中重要性排名最高的组分为L-尿苷（TI=0.34），L-尿苷为RNA成分D-尿苷的对映异构体，但缺乏抗CRC活性的相关报道。

KEGG通路富集分析：PI3K-Akt信号通路为DHZCP抗CRC通路中涉足基因数最多的信号通路，涵盖GSK3B、MAPK1、PIK3CG、CDK2、KDR、AKT1、NOS3 共计7 个靶点。值得注意的是，参照STRING在线数据平台分析结果，上述7 个靶点综合评分均居于靶点互作网络最前列，提示PI3KAkt信号通路可能为DHZCP发挥抗CRC作用的关键通路。DHZCP“单靶点”与“多靶点网络”联合的作用模式，或许为针对PI3K-Akt通路靶向药物的研发提供思路。

综上所述，基于网络药理学研究，初步探索了经典名方DHZCP治疗CRC的作用机制。DHZCP通过多靶点、多途径治疗CRC，属于系统性调控过程。至于DHZCP中化学成分与化学成分之间的相互作用、组分的含量以及药物在体内的代谢过程等对疾病的影响因素还需进一步探究。