颜子文，谢毅鹏，王车礼

1.常州大学药学院生物与食品工程学院，江苏 常州 213164；

2.常州大学石油化工学院，江苏 常州 213164

蛋白类酶是具有催化功能的生物大分子，与化学催化剂相比其具有诸多优点，如在常温常压下具有极高的活性及专一性。但蛋白质易受环境影响而变性失活[1-3]，其在工业上未能得到广泛应用。为了克服游离酶在应用上的诸多限制（如稳定性低、易受抑制及回收困难等），固定化酶技术应运而生[4-6]。传统酶固定化的方法有交联法、共价键法、吸附法和包埋法。近年来新型的复合物固定化技术受到了越来越多的关注，Ge 等[7]在2012 年首次提出采用有机-无机复合物对酶进行固定化，采用这种固定化方法，酶的稳定性、操作简易性和重复利用性有了很大的提高。Cui 等[8]用磷酸铜共沉淀牛胰腺脂肪酶，然后加入表面活性剂活化牛胰腺脂肪酶，其活性相比于未经活化的牛胰腺脂肪酶提高了460%。

金属有机骨架（MOF）具有超高的比表面积和稳定性，因而在化学催化、气体分离、药物输送等方面有极大的发展潜力[9]。MOF 是由金属离子通过配位键连接有机配体组成，金属离子和有机配体的连接可以形成众多的几何形状，因此可以根据功能需要设计和定制MOF 的结构[10]。沸石咪唑酸骨架（ZIF）是MOF 家族的一类，由于其出色的比表面积、热稳定性，以及合成条件温和简单、成本低等优点而被广泛研究[11-15]。ZIF 是由金属离子和2-甲基咪唑通过自组装形成的[16-18]。Liang 等[19]通过仿生矿化，将酶、蛋白质和脱氧核糖核酸（DNA）等生物大分子包埋进ZIF-8，由此提高了它们的稳定性以及重复利用性。Campbell 等[20]提出用ZIF-8 固定化脲酶，固化后的脲酶具有更好的温度耐受范围和稳定性。然而，合成条件对ZIF-8 固定化蛋白质有较大的影响，本研究将以牛血清蛋白（BSA）为模板蛋白，着力探究不同合成条件对ZIF-8 固定BSA（BSA@ZIF-8）固化物性质的影响，并采用扫描电镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、X 射线衍射仪（XRD）、激光粒度仪、物理吸附仪和热重分析等表征手段对制备出的复合物进行表征。

1 实验部分

1.1 ZIF-8 固定化BSA 的制备

按一定物质的量比将乙酸锌、2-甲基咪唑（HmIm）和H2O（Zn:HmIm:H2O）配置成混合溶液，于25 ℃下静置24 h，此时烧杯底部有白色沉淀生成，在7 000 r/min 下离心10 min 后去除上清液，沉淀物用去离子水洗涤三次，用冷冻干燥机干燥得到ZIF-8-1，ZIF-8-2，ZIF-8-3，ZIF-8-4（Zn:HmIm:H2O分别为1:20:450，1:20:890，1:20:2 228，1:40:2 228）。

将1 mg/mL 的BSA 溶液（50 mmol/L，一定pH 值的Tris-HCl 为缓冲溶液）加入上述乙酸锌和HmIm 混合溶液，在设定温度下固化一定时间，离心洗涤冻干后得到BSA@ZIF-8 复合物样品。计算其中BSA 的包埋率（α，掺入复合物中BSA 质量占合成时加入BSA 总质量的百分比）和负载率（β，复合物中包埋的BSA 占整个复合物质量的百分比）。

1.2 样品的表征

将冷冻干燥后的ZIF-8 以及BSA@ZIF-8 样品喷金处理后在5.0 kV 电压下进行SEM（JSM-5900，德国蔡司）检测，观察它们的表面形态。采用NEXUSFTTR670 型红外光谱仪（IS-50，美国赛默飞世尔）测定样品的FT-IR，溴化钾压片法。XRD 检测（MAX2500，日本岛津公司）采用Cu-Kα辐射，波长（λ）为0.154 18 nm，外加电压为40 kV，电流为30 mA，扫描2θ为7°～50°。使用马尔文ZS-90纳米粒度仪测定ZIF-8 及复合物粒径分布。采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量：取待测蛋白溶液1.0 mL置于10 mL 的试管中，加入5.0 mL 考马斯亮蓝溶液并震荡，反应5 min 后在595 nm 的波长下进行吸光度的测定。

2 结果和讨论

2.1 X 射线衍射

样品的XRD 表征结果见图1。由图1 可知，BSA@ZIF-8-4 的特征峰与ZIF-8-4 的特征峰非常相似，BSA@ZIF-8-4 复合物几乎保留了ZIF-8-4 的所有特征峰，说明加入BSA 以后依然形成了ZIF-8晶体。

图1 ZIF-8-4 以及BSA@ZIF-8-4 的XRD 图谱Fig.1 XRD spectra of ZIF-8-4 and BSA@ZIF-8-4

2.2 傅里叶红外光谱

图2 所示为样品的FT-IR 图谱。由BSA 图谱可见，1 649 cm-1处有一个吸收峰，其与酰胺I带在1 640～1 660 cm-1处的特征峰相吻合（主要来自C=O 伸缩振动），1 557 cm-1处的吸收峰则对应酰胺Ⅱ带在1 510～1 560 cm-1处的特征峰（主要来自C—N 伸缩振动及N—H 弯曲振动）。在ZIF-8-4 的FT-IR图谱上并未出现上述特征峰，而BSA@ZIF-8-4 复合物图谱中则出现了与BSA 相同的特征峰，证明BSA 已成功包埋于复合物内。

图2 ZIF-8-4，BSA@ZIF-8-4 和BSA 的傅里叶红外光谱Fig.2 FT-IR spectra of ZIF-8-4, BSA@ZIF-8-4 and BSA

ZIF-8-4 谱图中420 cm-1处的吸收峰为ZIF-8 独特的Zn—N 伸缩振动，692 cm-1及756 cm-1处的强烈吸收峰则属于咪唑环平面外弯曲振动，952 cm-1及1 310 cm-1处的吸收峰则为咪唑环平面内弯曲振动，1 450 cm-1处的强烈吸收峰为2-甲基咪唑甲基的弯曲振动。以上诸特征峰在BSA 的红外图谱中皆未体现，而在复合物谱图中出现了相应的特征峰，证明成功形成了ZIF-8 骨架。

2.3 热重分析

样品的热重分析结果见图3。由图3 可知，对于ZIF-8-4，在温度升至100 ℃后开始有质量损失，此时15.57%的质量损失为ZIF-8-4 晶体中所含的结合水，当温度升至 600 ℃后质量迅速损失，此时ZIF-8-4 开始分解。说明低于600 ℃时ZIF-8-4 有良好的热稳定性。由BSA@ZIF-8-4 的热重分析结果可知，样品在加热过程中也只有两个失重台阶。温度从100 ℃升至200 ℃的过程中，BSA@ZIF-8-4 复合物的质量损失为28.67%，与ZIF-8-4 相比多出13.10%的质量损失为包埋的BSA 及BSA 所带结合水。测量得知BSA@ZIF-8-4 中BSA 负载率约为3%（见表1），因此剩余约25%的质量损失均为结合水。当温度升至600 ℃后的质量损失仍为ZIF-8 骨架的降解。

表1 不同配比BSA@ZIF-8 的BSA 包埋率和负载率Table 1 Embedding ratios and loading ratios of BAS in BSA@ZIF-8 with different material ratios

图3 ZIF-8-4 和BSA@ZIF-8-4 热重分析结果Fig.3 Thermogravimetric analysis results of ZIF-8-4 and BSA@ZIF-8-4

2.4 粒径分析

Zn:HmIm:H2O 不同时制得的ZIF-8 和BSA@ZIF-8（恒定温度为25 ℃，反应时间为24 h，pH 值为7.4）的粒径分布见图4。由图4 可以看出，当ZIF-8 包埋入BSA 后，其颗粒粒径普遍增大，复合物的粒径普遍在100 nm 以上，但未超过1 000 nm，说明其晶体的生长存在一定的限制。

图4 不同Zn:HmIm:H2O 时制备的ZIF-8 以及BSA@ZIF-8 的粒径分布Fig.4 Particle size distributions of ZIF-8 and BSA@ZIF-8 synthesized for different Zn:HmIm:H2O

图5 为不同条件（pH，反应时间，温度）下制备的BSA@ZIF-8-3 的粒径分布。由图5（a）可见，4℃下制备的复合物的粒径分布更集中且平均粒径比25 ℃下的稍大，这可能是由于低温下晶体的生长速率较低、生长较均一；而40 ℃下晶体的生长速率较快但生长并不均一，导致其粒径较为分散。由图5（b）可知，合成时间为24 h 与72 h 时得到的复合物的粒径分布几乎一致，且均比合成时间为2h 时样品的要大，这说明当合成时间为2 h 时复合物晶体还在继续生长，时间达24 h 时已停止生长。由图5（c）可知，当pH 为中性（pH=7.4）时得到的复合物粒径稍小，这可能是因为酸性或碱性溶液中蛋白表面会带较多的正、负电荷，有利于复合物的形成。

图5 不同条件下制备的BSA@ZIF-8-3 的粒径分布Fig.5 Particle size distributions of BSA@ZIF-8-3 synthesized under different conditions

2.5 扫描电镜

不同配比的ZIF-8 以及对应复合物的扫描电镜照片见图6。由图6 可见，当Zn:HmIm:H2O 为1:20:450 时，合成的ZIF-8-1 颗粒轮廓较为模糊，当水的比例增大至2 228 时（ZIF-8-3），则呈现非常规则的正十二面菱形结构，而在此基础上再增加2-甲基咪唑的量（ZIF-8-4），则反而会导致结构出现缺陷。对应的BSA@ZIF-8 复合物（如图6E～图6H 所示）基本体现了相应的ZIF-8 结构但其表面十分粗糙，这可能是由于合成过程是以BSA 为内核的外延生长，从而导致生长不均一，晶体表面粗糙。

图6 不同配比的ZIF-8 以及对应BSA@ZIF-8 的SEM 图片Fig.6 SEM images of ZIF-8 with different material ratios and corresponding BSA@ZIF-8 BSA@ZIF-8: 25 ℃, 24 h, pH=7.4

2.6 复合物中BAS 的包埋率和负载率

不同配比ZIF-8 在固化温度为25 ℃，固化时间为24 h，缓冲溶液pH 值为7.4 的条件下制得了BSA@ZIF-8 复合物，其中BAS 的包埋率和负载率见表1。由表1 可知，当水的比例由450 增加至2 228时，BSA 的包埋率和负载率均有明显增加，而将2-甲基咪唑比例增加后，包埋率和负载率均有下降，说明2-甲基咪唑浓度的增加不利于BSA 的包埋和负载。

在不同固化温度、不同固化时间以及不同pH 缓冲溶液的条件下由ZIF-8-3 制备的BSA@ZIF-8-3中BSA 的包埋率和负载率见表2。如表2 所示，固定化温度对BSA 包埋率和负载率的影响较大，40 ℃下合成样品的BSA 负载率约为25 ℃下合成样品的一半，而包埋率却未有显著降低，说明较高的温度有利于ZIF-8 的生长，导致其晶体质量较大，负载率较低，图5（a）也印证了这一点。对比不同固化时间得到的样品的BSA 包埋率和负载率发现，从2 h 到24 h 有显著增加，而72 h 时有显著下降，说明在2～24 h 的固定化过程中复合物有一定生长，而24 h 以后部分复合物可能发生重构，一部分BSA重新溶解，从而导致其尺寸不变[见图5（b）]的情况下BSA 包埋率与负载率均降低。中性条件（pH=7.4）下得到复合物样品的BSA 包埋率和负载率明显更大，与图5（c）相结合分析可知，中性环境有利于BSA 的包埋，而酸性与碱性环境则有利于ZIF-8 晶体的生长。

表2 不同条件下得到的BSA@ZIF-8-3 的BSA 包埋率和负载率Table 2 Embedding ratios and loading ratios of BAS in BSA@ZIF-8-3 prepared under different conditions

3 结 论

本研究通过FT-IR、SEM、TGA 和激光粒度计对不同合成条件下制备的BSA@ZIF-8 复合物进行了表征分析。发现原料配比中2-甲基咪唑的浓度越高，BSA@ZIF-8 复合物中的BSA 负载率和包埋率越低，较高的固定化温度有利于ZIF-8 晶体的生成，从而导致较大的粒径和较低的BSA 包埋率和负载率，固定化时间在2～24 h 仍有生长，BSA@ZIF-8 复合物粒度与其中的BSA 负载率和包埋率均有显著增长，而24 h 以后一部分BSA 反而会重新溶解，中性固定化环境下有利于BSA 的包埋，而酸或碱性环境有利于ZIF-8 的生长。本工作对模板蛋白的研究结果可为其他酶的包埋研究提供一些参考。