靳志雄, 胡常晖, 张建军, 李 蕊

(张家口市第一医院1胃肠外科, 2肾内科, 3急诊科; 4河北北方学院附属第一医院骨外科, 河北 张家口 075000)

结直肠癌是消化系统常见肿瘤,多发于结肠与直肠,早期症状不明显,随着病情进展,可出现便血、腹泻腹痛、贫血等症状,近年来结直肠癌的发病群体逐渐呈年轻化趋势[1-2]。目前结肠镜检查和CT、MRI等影像学检查是早期筛查和诊断结直肠癌的主要手段,可有效预防结直肠癌发病[3]。随着医疗技术的不断发展,一些具有特异性的基因也被用于癌症的早期筛查[4]。纤溶酶原激活物抑制剂-1(Plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)是血浆中的一种蛋白质,属于纤溶系统的调节因子,它主要通过抑制纤溶酶原激活剂和尿激酶的活性达到调控纤溶系统功能的作用[5]。有研究显示靶向PAI-1抑制剂对于肿瘤的治疗具有重要意义[6]。此外也有研究表明PAI-1表达增强能够促进食管鳞癌细胞的恶性生物学行为,PAI-1的4G/4G基因型也被证实与恶性肿瘤患者合并静脉血栓栓塞有关[7-8]。本研究探究PAI-1 SNP与结直肠癌的发生风险之间的关系,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料以2019年5月-2021年5月张家口市第一医院胃肠外科收治的120例结直肠癌患者为病例组,其中男性54例,女性66例,年龄38～79岁,平均年龄(55.74±7.41)岁。另取同期80例健康体检者为对照组,其中男性47例,女性33例,年龄39～75岁,平均年龄(56.36±6.35)岁。收集两组相关资料,包括:BMI、吸烟史、饮酒史、家族史、是否久坐、排便频率、排便是否费力、接触毒害物质情况、肿瘤分期、肿瘤类型、淋巴结转移和远处转移情况。纳入标准:(1)诊断标准依据《中国早期结直肠癌筛查及内镜诊治指南》[9]进行,所有患者均符合结直肠癌的诊断标准;(2)活检或肿瘤根治术切除获得癌组织,经过病理诊断确诊;(3)临床资料与病理信息完整;(4)自愿参与研究。排除标准:(1)合并其他肿瘤;(2)有肿瘤病史;(3)患有严重的消化道性疾病或严重的营养不良;(4)中途退出研究。本研究经过张家口市第一医院伦理委员会批准,研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA样本的提取 分别抽取对照组和病例组外周静脉血5 mL,加入3倍体积的红细胞裂解液,充分混匀,放置在室温下静置5 min,12 000 r/min离心2 min,吸去上清液,收集沉淀。将沉淀中加入200 μL的溶液A,通过振荡完全混匀。向悬浮液中加入20 μL的RNase A (10 mg/mL),充分颠倒混匀,置于室温放置10 min,加入20 μL的蛋白酶K (10 mg/mL),充分颠倒混匀,置于60℃水浴中消化60 min。加入100 μL的溶液B,充分颠倒混匀。加入等体积的无水乙醇,充分颠倒混匀,将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中,室温放置2 min。12 000 r/min离心2 min,弃去废液,将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600 μL漂洗液,12 000 r/min离心2 min,弃去漂洗液,将吸附柱放回收集管中,重复漂洗1次。12 000 r/min离心2 min,将吸附柱敞口置于室温下以去除残留的漂洗液。将吸附柱放入离心管中,向吸附膜中央滴加150 μL经65℃预热的洗脱液,在室温下放置5 min后,12 000 r/min离心2 min。所得洗脱液加入吸附柱中,12 000 r/min离心2 min,即得到PAI-1高质量的基因组DNA。使用Nano Drop ND-1000微量分光光度计检测DNA的浓度和纯度。

1.2.2 PCR扩增 取“1.2.1”项下提取的DNA进行扩增,PAI-1引物序列,上游:5′-CTCTCTCTGCCCTCACCAAC-3′, 下游: 5′-GTGGAGAGGCTC-

TTGGTCTG-3′。GAPDH作为内参,其引物序列为:上游:5′-GTAGGTTCGGCTTAAA-3′,下游:5′-TTAGGTCCGCGTTTAGGATC-3′。 反应条件为 95℃变性10 min,95℃15 s,60℃退火1 min,共40个循环。60℃延伸30 s。

1.2.3 限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)酶切 使用Bsl I内切酶消化扩增产物,反应温度为55℃,反应时间为3 h,反应体系为:2 μL 10×NEB buffer,0.5 μL Bsl I内切酶,7.5 μL ddH2O,10 μL PCR substrate。

1.2.4 电泳分析 取4%琼脂糖凝胶在室温下静置30 min,放入电泳槽,加入1×TAE电泳缓冲液,取5 μL 酶切产物,100 V恒压电泳30 min,在紫外投射仪下观察结果,根据酶切条带判断基因型:5G/5G:74,46,22(bp), 4G/5G:96,74,46,22(bp), 4G/4G:96,46(bp)。

1.3 PAI-1单核苷酸多态性与结直肠癌发生风险的相关性分析采用二元Logistic风险回归模型分析PAI-1的3种基因型5G/5G、4G/5G、4G/4G和等位基因型4G、5G与结直肠癌发生风险的相关性,以是否发生结直肠癌作为因变量,PAI-1等位基因型作为自变量,计算比值比(Odds ratio,OR)及95%置信区间(Confidential interval,CI),当OR大于1时,表示自变量与因变量之间存在正向关联,即自变量的存在增加了因变量的发生风险;当OR等于1时,表示自变量与因变量不相关;当OR小于1时,表示自变量与因变量之间存在负向关联,即自变量的存在降低了因变量的发生风险。

2 结果

2.1 两组一般资料比较与对照组比较,病例组性别、年龄、BMI、吸烟史、饮酒史差异无统计学意义(P>0.05);病例组有结直肠癌家族史、久坐、排便频率异常及费力、接触毒害物质人数增多,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 Hardy-Weinberg检验对照组80例受试者中5G/5G型有46例,4G/5G型有29例,4G/4G型有5例,病例组120例受试者中5G/5G型有44例,4G/5G型有51例,4G/4G型有25例。与对照组比较,病例组5G/5G型、4G/5G型、4G/4G型指标差异无统计学意义(P>0.05),基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律,样本具有群体代表性,见表2。

表2 Hardy-Weinberg检验结果

2.3 两组PAI-1基因型分布情况比较与对照组比较,病例组中5G/5G型分布较少,4G/5G型、4G/4G型分布较多,差异存在统计学意义(χ2=11.900,P=0.003)。与对照组比较,病例组5G等位基因占比减少,4G等位基因占比增多(χ2=13.230,P<0.001)。4G/5G基因型携带者患结直肠癌的危险性是5G/5G基因型携带者的1.839倍,但差异无统计学意义(χ2=3.794,P=0.051)。4G/4G基因型携带者患结直肠癌的危险性是5G/5G基因型携带者的5.227倍(χ2=10.920,P=0.001)。4G等位基因携带者患结直肠癌的危险性是5G等位基因携带者的2.254倍(χ2=13.230,P<0.001),见表3。

表3 两组=PAI-1基因型分布情况比较

2.4 PAI-1基因型与结直肠癌发生的相关性分析Logistic回归模型分析结果显示PAI-1基因型(OR=5.039,P=0.003)、家族史(OR=165.3,P<0.001)、久坐(OR=8.428,P=0.006)、排便频率(OR=6.108,P=0.021)均与结直肠癌发生有显著关联,见表4。

表4 二元Logistic回归模型分析PAI-1基因型与结直肠癌发生的相关性

2.5 PAI-1基因型与结直肠癌病理特征的相关性PAI-1基因型与肿瘤分期(χ2=6.311,P=0.043)、 淋巴结转移(χ2=14.070,P=0.001)和远处转移(χ2=22.470,P<0.001)存在相关性,与肿瘤类型不存在相关性(χ2=3.661,P=0.454),见表5。

表5 PAI-1基因型与结直肠癌病理特征的相关性

3 讨论

PAI-1基因多态性和血管相关疾病的发病被证实存在关联,如PAI-1的4G/5G基因型与静脉血栓的发生有关且4G/4G基因型患者发生深静脉血栓事件的比例更高[10]。有研究表明PAI-1基因的rs1799768位点的4G/5G基因型与新生儿败血症风险显著增加有关,表明PAI-1基因通过影响纤溶系统来影响新生儿的败血症易感性[11]。PAI-1基因多态性也被证实与反复性流产有关[12]。Murakami等研究证实PAI1基因中特定的SNPs与膀胱癌的复发率和临床结局相关,这些SNPs会影响PAI-1的表达或功能,从而对肿瘤的侵袭和转移产生影响[13]。也有研究发现,PAI-1基因多态性与子宫内膜癌的发生风险增加相关,携带PAI-1 rs1799889的4G/4G基因型的个体在子宫内膜癌方面的风险显著增加,该研究分析了子宫内膜癌发病机制和风险预测的重要信息并揭示了PAI-1的作用[14]。本研究发现PAI-1基因型与结直肠癌发病风险显著相关,相对于健康人,结直肠癌患者携带PAI-1 4G/4G基因型的占比较多,这表明该基因型与结直肠癌的发展有关;结直肠癌患者中携带PAI-1 5G/5G基因型的占比较少,这表明该基因型对结直肠癌的发展有一定的保护作用。

本研究发现PAI-1基因型、家族史、久坐时间和排便频率与结直肠癌的发生密切相关,这对于结直肠癌的预防和筛查至关重要。临床上可以考虑通过基因检测和生活方式干预来降低患结直肠癌的风险。对于有家族史的人群,结直肠癌的筛查和监测尤为重要。PAI-1基因型与肿瘤分期、淋巴结转移和远处转移之间存在显著的相关性。说明PAI-1基因型对结直肠癌的发展和转移过程具有影响,使得不同基因型在分期和转移方面表现出不同的趋势。PAI-1基因型与肿瘤类型之间的相关性并不显著。这表明PAI-1基因型不会对结直肠癌的特定亚型的出现产生影响。

综上所述, PAI-1 4G等位基因与结直肠癌的发生发展密切相关,可作为早期诊断与筛选结直肠癌的重要指标。