姚亚妮, 罗鑫宇, 冯婷婷, 王子豪, 夏 欢, 杨新玲

(1新疆医科大学第一附属医院综合内四科, 乌鲁木齐 830011; 2新疆神经系统疾病研究重点实验室, 乌鲁木齐 830063;3新疆医科大学, 乌鲁木齐 830017)

帕金森病(PD)是一种中老年人常见的中枢神经系统锥体外系疾病。研究表明,铁沉积可能与铁代谢相关表达蛋白异常相关[1];铁转运蛋白二价金属离子转运体1(DMT1)在脑内黑质区表达升高,膜铁转运蛋白 1(FPN1)在脑内黑质区表达下降导致了该区域大量铁沉积[2]。6-羟基多巴胺(6-OHDA)和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的PD模型鼠中发现DMT1在黑质区表达增加,FPN1在PD模型鼠脑内黑质铁异常部位表达下降导致了该区域铁的选择性聚集[1-2]。提示PD黑质铁沉积与铁代谢的关键调节蛋白DMT1和FPN1异常有关。PD尸检结果显示,铁蛋白水平可反映小胶质细胞铁储存能力[3]。小胶质细胞在介导神经炎症反应的同时也参与调节铁代谢,炎症刺激可调节DMT1和FPN1蛋白的表达;DMT1和FPN1蛋白也可激活小胶质细胞的活性,释放白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤细胞坏死因子-α(TNF-α),对神经元细胞产生损害[4]。提示铁代谢相关调节蛋白异常表达和神经炎症交互作用可能引起了黑质铁沉积,造成了DA能神经元的损伤。本研究通过检测PD患者血清铁、铁蛋白(DMT1和FPN1蛋白)、炎症因子(IL-1β、 IL-6 及TNF-α),分析铁代谢与PD患者炎症因子、临床症状及病情严重程度的相关性,为后续铁代谢和神经炎症交互作用引起PD脑内铁沉积发病机制研究提供临床依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象选择2022年5月至2023年5月在新疆医科大学第一、二附属医院就诊50例PD患者(PD组)和50例健康体检者(对照组)。纳入标准:PD患者均由两位神经内科副主任医师根据英国PD协会脑库和2016年中国帕金森病诊断标准[5]确诊为PD,并进行PD相关运动症状评分[帕金森病量表III(UPDRSIII)]及非运动症状评分[Hoehn-Yahr(H-Y)分期、汉密顿焦虑量表(HAMA)、汉密顿抑郁量表(HAMD)、简易精神状态评价量表(MMSE)及蒙特利尔认知评估量表(MoCA)][6-7];对照组选择年龄、性别、生活方式等与PD组相匹配健康体检者。排除标准:帕金森病叠加综合征及继发的帕金森病综合征;精神病史及其他神经系统疾病;各种原因引起的贫血,如缺铁性贫血、遗传性血色素沉着病;服用铁补充剂患者;患有急性心衰、急性脑梗等严重心脑血管疾病、自身免疫性疾病、肝脏疾病、慢性肾脏疾病及恶性肿瘤的患者;过去6个月内严重失血或献血者;合并急慢性感染者。

1.2 研究方法

1.1.1 血清制备 在普通真空采血管中从病例和对照中收集 5 mL空腹外周静脉血。血样在室温下静置 30 min,然后以 2 800 rpm 的转速离心5 min。分离血清并于-20℃保存。

1.1.2 试剂盒 铁试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司);DMT1试剂盒、FPN1试剂盒、IL-1β试剂盒、IL-6 试剂盒、TNF-α试剂盒测定(上海江莱生物科技有限公司)。

1.2.3 实验方法 将血清梯度稀释后采用酶联免疫吸附试验检测血清铁、DMT1、FPN1、IL-1β、IL-6、TNF-α确定最佳血清稀释浓度。分别取50 μL和100 μL血清稀释成2倍后进行IL-6、血清铁水平测试。取20 μL血清稀释成5倍后按照制造商的说明书进行DMT1、FPN1、IL-1β、TNF-α水平检测。其中血清铁在酶标仪593 nm波长处测定各孔OD值,DMT1、FPN1、IL-1β、TNF-α、IL-6在酶标仪450 nm波长处测定各孔OD值。

2 结果

2.1 两组一般资料比较共纳入研究对象100例,其中PD组50例,平均年龄(67.6±11.50)岁,男性28人(56%),女性22人(44%),对照组50例,男性20人(40%),女性30人(60%),平均年龄(66.4±8.90)岁。两组一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 两组铁及铁相关蛋白水平比较PD组血清DMT1水平明显高于对照组(t=4.979,P<0.001);PD组血清FPN1水平低于对照组(t=-2.532,P<0.05);PD组血清铁水平中位数明显高于对照组(Z=-3.867,P<0.001)。见表2。

表2 两组铁及铁相关蛋白水平比较

2.3 两组炎症因子水平比较PD组血清IL-6水平中位数明显高于对照组(Z=-5.673,P<0.001)。PD组血清IL-1β水平中位数高于对照组(Z=-2.006,P=0.045)。PD组血清TNF-α水平中位数高于对照组(Z=-4.462,P<0.001)。见表3。

表3 两组炎症因子水平比较/(pg/mL)

2.4 PD患者铁及铁相关蛋白与炎症因子的相关性分析PD患者血清DMT1水平与血清IL-6水平相关(r=0.282,P=0.047);PD患者血清DMT1水平与血清TNF-α水平相关(r=0.347,P=0.014);而PD患者血清DMT1水平与IL-1β水平无相关性(P>0.05);PD患者血清FPN1水平与炎症因子(IL-6、IL-1β及TNF-α)无相关性。见表4。

表4 PD患者铁及铁相关蛋白与炎症因子的相关性分析

2.5 PD患者铁及铁相关蛋白、炎症因子与临床症状及病程的相关性分析PD患者DMT1与UPDRS III评分相关(r=0.454,P=0.001);PD患者IL-1β与UPDRS III评分相关(r=-0.288,P=0.043);PD患者IL-6与认知功能(MOCA)相关(r=0.420,P=0.002);PD患者中TNF-α与病程相关(r=0.294 ,P=0.038)。见表5、6。

表5 PD患者铁及铁相关蛋白与临床症状及病程相关性分析

表6 PD患者炎症因子与临床症状及病程相关分析

3 讨论

铁代谢的平衡主要通过调节铁转蛋白受体1(TfR1)、DMT1(+IRE)以及FPN的合成来实现。铁转蛋白受体(TfR)分为TfR1、TfR2(铁转蛋白受体2)两种类型,但对铁代谢起调节作用的只有TfR1;DMT1根据其mRNA水平是否含有铁调节元件(Iron regulatory element,IRE)分为DMT1(+IRE)与DMT1(-IRE)两种类型,但对铁代谢真正起调节作用的只有DMT1(+IRE)[12]。有研究报道,PD铁沉积可能与铁代谢关键调节蛋白表达失控有关[10]。本研究结果显示PD组血清 DMT1水平明显高于对照组;PD组血清FPN1水平低于对照组;PD组血清铁水平明显高于对照组。提示PD患者外周血清中发现铁代谢紊乱。既往研究结果显示,PD患者脑内TfR密度和正常人并无显著差异;6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的PD模型大鼠黑质中显示正常对照组与PD模型组黑质内TfR表达差异无统计学意义,证明TfR可能与黑质内铁沉积无关[11]。PD尸检结果显示在脑内黑质区DMT1水平升高和FPN1水平下降导致该区域铁大量聚集[12-13]。6-OHDA和MPTP诱导PD模型鼠中,DMT1和FPN1在PD模型鼠脑内铁异常沉积部位黑质、红核、苍白球、壳核表达异常[14]。本研究结果提示,PD患者存在铁蛋白代谢紊乱。

神经系统炎症反应是神经系统对外界刺激的一种防御性反应,也是中枢神经系统疾病损伤最常见的病理机制。PD神经系统炎症反应主要涉及神经小胶质细胞激活、炎症因子、趋化因子的释放等,与PD的发生发展密切相关[15-16]。铁代谢与神经系统炎症之间存在相关性,铁代谢相关蛋白(铁调素、DMT1、TfR、铁蛋白、FPN)在小胶质细胞内均有表达,IL-1β、 IL-6 及TNF-α炎症刺激可增加神经元DMT1和 FPN1的表达,引起铁聚集[17-18];DMT1和 FPN1表达增多可诱导小胶质细胞促炎性细胞因子(IL-1β、IL-6及TNF-α)进一步释放,加重神经炎症损伤。小胶质细胞作为神经系统重要的免疫炎症细胞,通过介导炎症反应激活铁代谢途径,引起细胞内铁过载,导致神经元损伤;细胞铁代谢紊乱亦可引起细胞促炎表型极化,加重炎症反应[19-22]。本研究发现PD患者血清DMT1水平与血清IL-6、TNF-α水平相关;而PD患者血清DMT1水平与IL-1β水平无相关性;PD患者血清FPN1水平与炎症因子(IL-6、IL-1β及TNF-α)无相关性。提示PD患者外周血中铁代谢相关蛋白DMT1与炎症因子存在交互作用。本研究结果显示PD患者DMT1与UPDRS III评分相关;PD患者IL-1β与UPDRS III评分相关;PD患者IL-6与认知功能(MOCA)相关;PD患者中TNF-α与病程相关。

综上,PD患者发病可能与血清中铁代谢蛋白紊乱、炎症因子和PD运动症状存在相关性。但本研究样本量较小,今后应扩大样本量,进一步验证本研究结果。